高效液相色譜柱

一、怎樣選擇色譜柱

現代高效液相色譜中，分離效果好壞很大程度上取決于色譜填料的選擇。但是色譜填料的選擇范圍很寬，要做合適的選擇，必須對此有一定的認識和了解。

（1）硅膠基質填料：

1、正相色譜

正相色譜用的固定相通常為硅膠（Silica），以及其他具有極性官能團，如胺基團（NH2，APS）和氰基團（CN，CPS）的鍵合相填料。

由于硅膠表面的硅羥基（SiOH）或其他團的極性較強，因此，分離的次序是依據樣品中的各組份的極性大小，即極性強弱的組份最先被沖洗出色譜柱。

正相色譜使用的流動相極性相對比固定相低，如：正乙烷（Hexane），氯仿（Chloroform），二氯甲烷（Methylene Chloride）等。

2、反相色譜

反相色譜填料常是以硅膠為基礎，表面鍵合有極性相對較弱的官能團的鍵合相。反相色譜所使用的流動相極性較強，通常為水，緩沖液與甲醇，已腈等混合物。

樣品流出色譜柱的順序是極性較強組合最先被沖出，而極性弱的組份會在色譜柱上有更強的保留。

常用的反相填料有C18（ODS）、C8（MOS）、C4（B）、C6H5（Phenyl）等。

（2）聚合物填料

聚合物調料多為聚苯乙烯-二乙烯基苯或聚甲基丙酸酯等，其主要優點是在pH值為1～14均可使用。相對與硅膠基質的C18填料，這類填料具有更強的疏水性；大孔的聚合物填料對蛋白質等樣品的分離非常有效。

現在的聚合物填料的缺點是相對硅膠基質填料，色譜柱柱效較低。

（3）其他無機填料

其它HPLC的無機填料色譜柱也已經商品化。由于其特殊的性質，一般僅限于特殊的用途。如石墨化碳也用于正逐漸成為反相色譜填料。

這種填料的分離不同與硅膠基質烷基鍵合相，石墨化碳的表面即是保留的基礎，不再需其它的表面改性，該柱填料一般比烷基鍵合硅膠或多孔聚合物填料的保留能力更強，石墨化碳可用于分離某些幾何導構體，又由于HPLC流動相中不會被溶解，這類柱可在任何pH與溫度下使用。

氧化鋁也可用于HPLC，氧化鋁微粒剛性強，可制成穩定的色譜柱柱床，其優點是可在pH高達12的流動相中使用。

但由于氧化鋁與堿性化合物作用也很強，應用范圍受到一定的限制，所以未能廣泛應用，新型氧化鋯填料也可用于HPLC，商品化的僅有聚合物涂層的多孔氧化鋯微球色譜柱，應用pH范圍1～14，溫度可達100℃。

由于氧化鋯填料幾年前才開始研究，加之面臨的實驗難度，其重要用途與優勢尚在進行中。

二、怎樣選擇填料粒度

目前，商品化的色譜料粒度從1um到超過30um均有銷售，而目前分析分離主要用3um、5um和10um填料，填料的粒度主要影響填充柱的兩個參數，即柱效和背壓。粒度越小，填充柱的柱效越高；小于3um的填料應用，在相同選擇性條件下，提高柱效可提高分離度，但不是唯一的因素。

如果固定相選擇是正確，但是分離度不夠，那么選擇更小粒度的填料是很有用的，3um填料填充柱的柱數比相同條件下的5um填料的柱效提高近30%；然而，3um的色相譜的背壓卻是5um的2倍。

與此同時，柱效提高意味著在相同條件下可以選擇更短的色譜柱，以縮短分析時間，另外，可以采用低粘度的溶劑做流動相或增加色譜柱的使用溫度，比如用乙腈代替甲醇，以降低色譜柱的壓力。

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