Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)總結(jié) －Transwell的其他應(yīng)用的實(shí)驗(yàn)步驟
1．Transwell腫瘤細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)
過(guò)程與Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)基本一致，不同的只是不需要鋪Matrigel。個(gè)人認(rèn)為，由于沒(méi)有基質(zhì)膠的阻擋，細(xì)胞穿過(guò)膜的速度較侵襲實(shí)驗(yàn)明顯加快，所以細(xì)胞量要更大。我做侵襲實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞密度是1×105，而遷移實(shí)驗(yàn)的密度是1×106。另外，下層培養(yǎng)液的FBS濃度也可適當(dāng)下調(diào)，我做侵襲實(shí)驗(yàn)的濃度是5%，遷移實(shí)驗(yàn)的濃度是2.5%。
2．Transwell上皮細(xì)胞培養(yǎng)步驟
做了一段時(shí)間的原代細(xì)胞培養(yǎng)，把經(jīng)驗(yàn)?zāi)贸鰜?lái)跟大家分享一下吧，請(qǐng)有關(guān)戰(zhàn)友共同探討：
(1). 將雄性wistar大鼠麻醉，開(kāi)胸，將氣管取出，置于4℃含0.1％胰蛋白酶XIV (Sigma)，100 U/ml青霉素和100ug/ml鏈霉素（Gibco-BRL）、無(wú)Ca 2＋、Mg2＋，無(wú)血清的MEM。
(2). 用無(wú)菌的細(xì)胞刮棒刮氣管內(nèi)壁，將所得溶液離心后得到游離細(xì)胞。
(3). 離心后立即用新鮮的上述MEM溶液（含10％胎牛血清）清洗3次，以中和胰蛋白酶，再用含5％胎牛血清、100U/ml 青霉素和100 ug/ml 鏈霉素的LHC-8 medium (Biofluids)沖洗一次。
(4). 沖洗過(guò)后，將得到的細(xì)胞懸液用臺(tái)盼蘭測(cè)定活力，若存活率大于90％，則將細(xì)胞以106/cm2密度接種于可通透的多聚碳濾膜上（12 mm SNAPWELL, Costar），以37°C 5％CO2-95% 空氣含5% 胎牛血清(Gibco-BRL) and 100 U/ml 青霉素and 100ug/ml 鏈霉素的LHC-8 medium孵育6~10天。
(5). 孵育后，經(jīng)測(cè)定跨上皮電阻在1000~2000Ω之間，即可用于電生理試驗(yàn)。
顯微鏡下氣管上皮細(xì)胞形細(xì)胞呈鋪路石狀，圓形核位于中央，生長(zhǎng)時(shí)常彼此緊密連接成單層細(xì)胞片
3. Transwell B16細(xì)胞的體外遷移實(shí)驗(yàn)
我以前用 costar的Transwell做過(guò)B16細(xì)胞的體外遷移實(shí)驗(yàn)，具體是這么做的：首先把Transwell倒置，在Transwell的PVPF膜（0.8 um）的下表面涂一層fibronectin(10 ug/ml，50ul),37度2小時(shí)，PBS洗一遍后，放入預(yù)先每孔加有600ul的培養(yǎng)基（含10%血清）的24孔板內(nèi)，后在Transwell的內(nèi)室加入細(xì)胞（100ul,用含0.1%血清的培養(yǎng)基稀釋好自己所需密度），放入培養(yǎng)箱，12-18小時(shí)后，取出Transwell，用棉簽擦去PVPF膜靠近內(nèi)室那一面的細(xì)胞，另一面的細(xì)胞用甲醛室溫固定30分鐘，結(jié)晶紫染色20分鐘，用清水洗3遍以上，后在顯微鏡下觀察細(xì)胞，記數(shù)。
4．內(nèi)皮細(xì)胞HMEC-1遷移實(shí)驗(yàn)
1%明膠處理的transwell經(jīng)無(wú)血清的MCDB131培液于培養(yǎng)箱中平衡1小時(shí)后，上室加入100μl用serum-free MCDB131稀釋的5*104/孔的HMEC及不同濃度的藥物，下室加入0.6ml serum-free的MCDB131培液及20%FCS刺激遷移,同時(shí)設(shè)置相應(yīng)陰性及陽(yáng)性對(duì)照，置于CO2培養(yǎng)箱中作用8小時(shí)，然后棄去孔中培液，用90%酒精常溫固定30分鐘，0.1%結(jié)晶紫常溫染色10分鐘，清水漂凈，用棉簽輕輕擦掉上層未遷移細(xì)胞，顯微鏡(Olympus, DP50, Japan).下觀察并拍照，最后用10%乙酸100μl/孔抽提10分鐘，于600nm處測(cè)定OD值。抑制率計(jì)算公式為：抑制率（%）=[(OD值給藥組-OD值無(wú)刺激陰性對(duì)照)/（OD值不加藥陽(yáng)性對(duì)照- OD值無(wú)刺激陰性對(duì)照)] ×100%.
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