293T細胞的培養實驗步驟

293T細胞的培養主要有以下步驟：
一、293T細胞的凍存

1. 隨著傳代的次數增加，293T細胞會出現生長狀態下降，出現突變 等。所以要在細胞購進時就進行大量凍存，以保證實驗的穩定性和持續性。

2. 在細胞對數生長期進行凍存，增加細胞復蘇成活率。

3. 倒去細胞上清液，加入D-Hank's液洗去殘留的培養基。

4. 加入0.25%的胰酶，消化10-20s后倒去。

5. 鏡下觀察細胞變圓，細胞間間隙加大時，加入新鮮培養基吹打混勻。

6. 細胞計數。

7. 將細胞離心，1000rpm，2min。

8.根據計數結果加入細胞凍存液(70%完全培養基+ 20% FBS + 10% DMSO )重懸細胞，密度為3×106個/ml。

9. 分裝進細胞凍存管，放入泡沫盒中，放入-80℃超低溫冰箱 。

10. 第二天將細胞放入液氮灌，并記錄。

11. 復蘇檢測細胞存活率，細胞狀態等，并記錄。

二. 293T細胞的傳代

1. 當細胞生長至匯合率達到80~90%需要對細胞進行傳代操作，以擴大細胞數量，維持細胞良好的生長狀態。

2. 消化細胞，方法同上。

3. 細胞離心結束后，加入完全培養基重懸。密度為3×105個/ml。

4. 分到10cm培養皿中，10ml/皿。

5. 放回37℃、3%CO2和95%相對濕度的培養箱中培養。

三. 293T細胞的復蘇

1. 當細胞傳代次數過多(超過50代)，細胞狀態變差時或細胞出現污染事故時，需要丟棄并對開始凍存的細胞進行復蘇。

2. 打開水浴鍋，設置溫度為40℃。

3. 查看細胞庫記錄，根據記錄從液氮灌中取出凍存的細胞(需戴上棉手套，防止被凍傷)，迅速丟入水浴鍋中并快速晃動，在1~2 min內使細胞溶液完全溶解。

4. 將1ml細胞溶液加入9 ml完全培養基中并混勻后轉入10cm培養皿。

5. 放回37℃、3%CO2和95%相對濕度的培養箱中培養。

6. 第二天觀察細胞存活率。倒掉舊的培養基，加入10ml新鮮培養基。

用于包裝的293T細胞的培養

用于包裝的293T細胞(ATCC No. CRL-11268)必需選擇處于生長旺盛期，細胞狀態較佳，存活率90%以上，細胞邊緣清晰，傳代次數較低。任何時候細胞匯合率都不準達到100%。

慢病毒 的包裝

1. 預先準備3個T150瓶的293T細胞，培養基為DMEM + 10% FBS，1% Glutamax ，1% 青霉素-鏈霉素。

2. 將細胞分到12分到12個T150瓶中，每瓶的細胞密度是8×106個。

3. 第二天，鏡下檢查細胞。細胞融合度應大致為30-40%，分布均勻。

4. 轉染前1小時，取出細胞板，去除原有細胞培養基，加入20ml的Opti-MEM培養基，將細胞送回培養箱。

5. 取兩支無菌的50ml離心管，其中一支中加入252 μg pNL-EGFP/CMV/WPREDU3 載體質粒，168 μg pCD/NL-BH*DDD 包裝質粒和84 μg pLTR-G質粒，用Opti-MEM培養基補齊到18ml。另一支中加入500 μl Trans-EZ溶液和17.5 ml Opti-MEM培養基，用電動移液器輕輕混勻。將Trans-EZ稀釋液滴加到質粒管中，邊加邊輕輕晃勻。

關鍵步驟：推薦使用Qiagen質粒大抽試劑盒或相當的試劑盒所制備的質粒。

6. 室溫孵育20分鐘，使DNA和Trans-EZ充分結合形成轉染復合體。

7. 取1支5ml的移液管，將得到的DNA-Trans-EZ復合體均勻滴加入到細胞培養板中，每板3ml。來回晃動培養板，混勻后放回到5%二氧化碳培養箱。每一皿細胞培養盤不要超過6盤。

8. 6小時后，移去細胞上清，更換為17ml的DMEM完全培養基。

9. 轉染后一天觀察細胞，所有的細胞應當都是健康的并且密度接近60-80%。如果所轉染質粒帶有GFP熒光，那么這時候可以看到大于95%的細胞都是帶有熒光的。

10. 將細胞送回培養箱繼續培養2天(36-48小時)。在這個過程中，細胞會逐漸融合形成多核體，大多數的細胞依然貼壁。

11. 收集所有的上清，分裝到50ml離心管中。

12 4℃，500g離心10分鐘，除去脫落的細胞和大的細胞碎片。

13 總的上清約為204 ml，用250-ml 0.45 μm PVDF過濾裝置過濾。如果發現濾膜被堵住，表現為過濾速度變慢，更換新的濾器。

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