細胞培養污染之支原體污染檢測

細胞培養 中常遇見的有細菌污染、真菌污染、支原體污染、病毒污染等，說起支原體污染，估計細胞培養的同學就開始犯愁了，細胞培養的老手都知道，支原體污染非常不易察覺，怎么才能檢測支原體污染呢?

1、細菌 、真菌污染的檢測

(1)肉眼觀察 細菌、真菌污染常在傳代、換液、加樣等開放性操作之后發生，而且增生迅速，若有污染，在48小時內可明顯觀察到。如培養液變混濁，或略加振蕩有很多漂浮物漂起。

(2)鏡下觀察 在倒置顯微鏡的高倍鏡下可見培養液中有大量圓球狀顆粒漂浮，即為細菌污染。若細胞之間有絲狀、管狀、樹枝狀或卵形的物質常為真菌污染。

(3)接種觀察 采用普通肉湯接種或用未加雙抗藥物的培養液接種，也可發現是否有污染。

支原體是一種大小介于細菌和病毒之間(最小直徑0.2um)并獨立生活的微生物 .約有1%可通過濾菌器。支原體無細胞壁形態呈高度多形性.可為圓形、絲狀或梨形。

支原體形態多變，在光境下不易看清內部結構。電鏡下觀察支原體膜為三層結構.其中央有電干密度大的密集顆粒群或絲狀的中心束。支原體多吸附或散在于細胞表面和細胞之間。橫斷面與細胞微絨毛相似，但微絨毛電子密度比支原體小，且中央無顆粒群或中央束。

2、支原體污染的檢測

支原體代謝需固醇類物質、部分種類需要精氨酸、O 2或葡萄糖，每一種支原體都有自身持點。多數支原體適合于偏堿條件下生存(PH7.6—8.0)，對酸耐受性差。對熱比較敏感，對一般抗生素不敏感。

支原體污染細胞后.培養液可不發生混濁.多數情況下細胞病理變化輕微或不顯著，細微變化也可由于傳代、換液而緩解.因此易被忽視。但個別嚴重者，可致細胞增殖緩慢.甚至從培養器皿脫落。

為確定有無支原體污染可做如下檢測：

①相差顯微境檢測：將細胞按種于事先放置于培養瓶內的蓋玻片上，24h后取出，用相差油鏡觀察.支原體呈暗色微小顆粒位于細胞表面和細胞之間。

②熒光染色法：熒光染色用能與DNA特異性結合的熒光染料Hoechst 33258，可使支原體內含有的DNA著色，染色后用熒光顯微鏡觀察。具體方法如下：首先將細胞接種蓋玻片上，在細胞未長滿前取出玻片，用不合酚紅的Hanks液漂洗一下，用l： 3醋酸甲酵固定10Min，然后用生理鹽水漂洗.置于用生理鹽水配濃度為50pg/ml的Hoechst 33258中染色10min。染色后用蒸溜水洗1—2min.向細胞面滴加pH5.5磷酸緩沖液數滴，然后置熒光顯微鏡下觀察。鏡下支原體為散在于細胞同圍或附于細胞膜表面的亮綠色小點。

③電鏡檢查;用掃描電鏡方法簡便快速.也可以利用透射電鏡。

④DNA分子條文檢查或支原體培養等方法：檢出率高.但方法較為復雜

支原體是一類缺乏細胞壁的原核細胞型微生物，大小一般在0.3-0.5um之間，呈高度多形性，有球形、桿形、絲狀、分枝狀等多種形態。它不同于細胞，也不同于病毒。支原體用普通染色法不易著色，用姬姆薩染色很淺，革蘭染色為陰性。支原體可在雞胚絨毛尿囊膜上或細胞培養中生長，營養要求比細菌高。

細胞培養(特別是傳代細胞)被支原體污染是個世界性問題。在細胞培養中支原體感染發生率達到63%，支原體感染發生后能改變細胞的DNA,RNA及蛋白表達，又不能通過可視法對其進行檢測，而且它對細胞的生長率影響較小，不易引起注意。國內外研究表明，95%以上是以下四種支原體：口腔支原體(M.orale)、精氨酸支原體(M.arginini)、豬鼻支原體(M.hyorhinis)和萊氏無膽甾原體(A.laidlawii)，為牛源性。以上是最常見的污染細胞培養的支原體菌群，但能夠污染細胞的支原體種類是很多的，國外調查證明，大約有二十多種支原體能污染細胞，有的細胞株可以同時污染兩種以上的支原體。

支原體污染的來源包括工作環境的污染、操作者本身的污染(一些支原體在人體是正常菌群)、培養基的污染、污染支原體的細胞造成的交叉污染、實驗器材帶來的污染和用來制備細胞的原始組織或器官的污染。

組織細胞培養工作中，主要從以下幾個方面來預防支原體的污染：控制環境污染;嚴格實驗操作;細胞培養基和器材要保證無菌;在細胞培養基中加入適量的抗生素。支原體污染細胞后，特別是重要的細胞株，有必要清除支原體，常用方法有抗生素處理、抗血清處理、抗生素加抗血清和補體聯合處理。支原體最突出的結構特征是沒有細胞壁，一般來講，對作用于細胞壁生物合成的抗生素，如 -內酰胺類、萬古霉素等完全不敏感;對多粘菌素(polymycin)、利福平、磺胺藥物普遍耐藥。對支原體最有抑制活性及常用于支原體感染治療的抗生素是四環素類、大環內酯類及一些氟喹諾酮;其他類抗生素如氨基糖苷類、氯霉素對支原體有較小抑制作用，所以常不用來作為支原體感染的化學治療劑。InvivoGen公司研究開發的新一代支原體抗生素M-Plasmocin能有效地殺滅支原體，不影響細胞本身的代謝，并且用M-Plasmocin處理過的培養細胞，不會重新感染支原體。

支原體污染在細胞培養中實際上是比較常見的, 據資料, 可達30%甚至更高. 支原體污染時細胞表現為長得不好,也不死亡, 同時, 培養基又是清亮的. 時間長達一周也沒有什么變化. 這時基本上可以判斷出是支原體污染了, 愿意檢測就檢測一下,不愿意直接用清除試劑處理吧.

避免細胞污染，可以從預防著手，超凈工作臺物品放置要合理、進入細胞房要換鞋和穿實驗服、實驗員戴手套后要用酒精等消毒、避免細胞交叉污染等等。