混合淋巴細胞培養

細胞培養 （Cell Culture）專題：

　　混合淋巴細胞培養(MLC)或稱混合淋巴細胞反應(MLR)常用于器官移植前的組織配型，以測定受體和供體主要組織相容性抗原 (HLA抗原)相容的程度。由于MLC中淋巴細胞接受同種異型抗原的刺激而發生活化、增殖，產生種類眾多的細胞因子，促進NK、LAK和CTL等殺傷細胞的分化，因此又是免疫調節研究中常用的實驗模型。

　　(一)　實驗原理

　　兩個無關個體功能正常的淋巴細胞在體外混合培養時，由于HLAⅡ類抗原中D和DP抗原(淋巴細胞鑒定的抗原,SD抗原)不同，可相互刺激對方的T細胞發生增殖，此為雙向混合淋巴細胞培養(two way MLC);若將其中一方的淋巴細胞先用絲裂霉素C(mytomycine C)處理或射線照射使之細胞中DNA失去復制能力，但仍能刺激另一方淋巴細胞發生轉化，稱為單向混合淋巴細胞培養(one way MLC)。

兩個個體間HLA抗原差異程度越大，反應越強烈，可通過細胞數量、形態檢查或３H-TdR摻入率檢測反應細胞的增殖水平。如用經照射的、已知D位點抗原的純合子分型細胞(Homozygous typing cell,HTC)作為刺激細胞，則可檢測待檢者的D位點抗原型別。

若待檢者抗原與標準HLA-D抗原相同，MLC不發生增殖，此為HLA-D抗原陰性分型法。EB病毒轉化的B淋巴母細胞表達高水平的HLAⅡ類抗原，常作為單向混合淋巴細胞培養中的刺激細胞。

　　(二)　操作步驟

　　1.　刺激細胞的準備　常用的刺激細胞有EB病毒轉化的B淋巴母細胞(如N２３細胞株，經過克隆化)、HTC或PBMC。取處于對數生長期的N２３細胞，離心后重懸于新鮮完全培養基中，調整細胞數為1～2×10６／ml，移置塑料培養瓶或50ml離心管中，用６０Co照射3000ra.

　　2.　反應細胞的準備　　分離純化待檢個體的PBMC（方法參見"密度梯度離心法分離PBMC"）。

　　3.　MLC按2×10６PBMC: 1×10５照射的N２３細胞／4ml 10％ FCS RPMI1640 比例在培養瓶中進行MLC，培養瓶保持直立，培養4天內不要晃動，第5天加入1ml新鮮培基。

如要測定３-TdR摻入率，一般可在MLC的第5天進行；如要檢測MLC中NK、LAK或特異性殺傷性T淋巴細胞(犆TL)，一般在7～10天左右終止培養，收獲效應細胞。殺傷細胞功能檢測參見"自然傷細胞(NK)和淋巴因子激活的殺傷細胞(LAK)的殺傷功能"，所不同的是在96孔培養板中靶細胞數為5×10３／孔。

CTL的靶細胞選用作為刺激細胞的N２３細胞。

　　(三)　試劑器材

　　1.　細胞　刺激細胞N23細胞系，反應細胞：外周血單個核細胞。

　　2.　10％FCS　RPMI1640培養基。

　　3.　照射源：６０Co、X射線裝置。

　　4.　細胞培養瓶、培養板、滴管、吸管等。

　　5.　Co孵箱、超凈臺。

　　(四)　注意事項

　　1.　注意無菌操作。

　　2.　刺激細胞接受照射劑量要準確，使細胞暫時存活，但失去增殖的能力。

　　3.　可用Raji或Daudi細胞作為刺激細胞，也可將不同的細胞混合作為刺激細胞。