原代軟骨細(xì)胞分離培養(yǎng)

以兔軟骨細(xì)胞為例：
①一般根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求，選取不同年齡組的兔子，實(shí)際上兔子的年齡越小越好，畢竟幼體組織的活力要高于成體組織的活力，耳靜脈空氣注射法處死后,無(wú)菌條件下分離后肢關(guān)節(jié)軟骨和肋軟骨，剝離包裹軟骨組織的筋膜和軟骨膜，放入盛有PBS液的培養(yǎng)皿中。
②將分離得到的軟骨組織剁碎成0.3-0.5mm的組織塊，移入25cm2培養(yǎng)瓶，用含雙抗的PBS液沖洗軟骨3次。
③加入軟骨體積10-15倍的0.25%胰蛋白酶，37℃消化１－２小時(shí)后終止消化。
④加入0.02%II型膠原酶，37℃消化17-20小時(shí)（也就是過(guò)夜），這是我們實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)期摸索出來(lái)的方法，雖然比較浪費(fèi)時(shí)間，但是獲得的細(xì)胞活力確實(shí)不錯(cuò)。
⑤在倒置顯微鏡下觀察，當(dāng)游離出單個(gè)細(xì)胞后，加入DMEM培養(yǎng)液將II型膠原酶稀釋終止消化。
⑥將細(xì)胞團(tuán)吹打成單個(gè)細(xì)胞后用200目濾網(wǎng)過(guò)濾，收集濾液，1500r/min離心5min。
⑦棄上清，加入DS培養(yǎng)液重懸，0.2%臺(tái)盼藍(lán)染色，活細(xì)胞率大于90%，CO2培養(yǎng)箱孵育。