氰化高鐵血紅蛋白測定法及紅細胞計數的方法與注意事項

本實驗的主要目的是掌握氰化高鐵血紅蛋白測定法原理、方法與操作步驟；掌握血細胞計數板的使用和結構；了解紅細胞計數的原理、方法與步驟。具體實驗方法如下：

實驗目的要求：

通過血紅蛋白測定、紅細胞計數實驗要求：

1、掌握紅細胞計數、血紅蛋白測定的原理、方法及注意事項。

2、掌握血細胞計數板的結構

一、血紅蛋白測定(Hemoglobin簡稱Hb)

(氰化高鐵血紅蛋白法)

【原理】

血紅蛋白中的亞鐵離子(Fe2+)被高鐵氰化鉀氧化成高離子(Fe3+)，血紅蛋白轉化成高鐵血紅蛋白，高鐵血紅蛋白與氰離子(CN-)結合，生成穩定的氰化高鐵血紅蛋白。用光電比色計在540nm波長比色。從HicN參考液制作的標準曲線上讀取血紅蛋白克數。

【操作】

取試劑5毫升加入血液20ul混勻置5分鐘后用721光電比色儀，540nm波長，試劑為空白調0點比色，讀取光密度，查標準曲線得結果。

二、紅細胞計數(red blood Cell 簡稱RBC)——顯微鏡直接計數(試管法)

【原理】

一定量的血液經一定量等滲性稀釋液稀釋后，充入血細胞計數池中顯微鏡下計數一定容積內的細胞，再換算成每升標本的細胞數報告。

【操作方法】

l、取紅細胞稀釋液2.0ml毫升，放入一小試管內。

2、用血紅蛋白吸管吸血至l0ul處。

3、擦去管尖外部余血將血液迅速輕輕吹入盛有紅細胞稀釋液的試管內，吸上清液嗽洗吸管2-3次，立即搖勻。

4、用玻棒取混懸液少量，充入計數池內。

5、待2—3分鐘，讓紅細胞完全下沉后，將計數板平放在顯微鏡臺上，用低倍鏡觀察，如紅細胞分布均勻即可換高倍鏡進行計數。

紅細胞計數的區域:

中心大方格中的5個中方格(正中一個和四角各一個)。

計數原則:

數上不數下，數左不數右的計數原則即凡壓在中方格邊線(雙線)上的紅細胞，只計上側與左側線上的細胞，而壓在下側與右側線上者不計入。

注意事項：

1、吸管、試管要注意清潔、干燥以防溶血，操作迅速避免血液凝固，如有血凝塊應重新采血。

同時做血紅蛋白測定，白細胞計數和分類計數，在采血時應先做血膜再做紅細胞，然后做白細胞，血紅蛋白檢驗，避免紅細胞破壞。

2、充液：

充液前，紅細胞復液要充分搖勻，紅細胞懸液注入計數池內要求分布均勻，不可有氣泡，亦不可有多余液體外溢。

3、質量控制：

中方格內紅細胞分布應均勻，健康成人每中方格紅細胞數約為80—100個，各中方格內之紅細胞相近，如懸殊過大(超過10個細胞以上的)應重混勻再充填。

報告方式：

Hb ： g/L

RBC: ×l012/L

小結：在測定血紅蛋白吸光值前，需要校準分光光度計，HicN參考液中KCN是劇毒物品，配制的時候一定要嚴格按照程序操作，避免溶液對自身的傷害。