細(xì)胞復(fù)蘇的主要步驟及注意事項，有哪些？
主要步驟：
①將冷凍管從液氮中取出，迅速投入37℃水浴融化，細(xì)胞融化后要盡快(約1min)移出37℃水浴。37℃水浴時間延長會提高細(xì)胞死亡率，復(fù)蘇過程中一般細(xì)胞死亡率在20%～25%之間。
②迅速用酒精棉球擦拭冷凍管外部殺菌消毒，然后放置在冰浴上。
③小心開啟瓶蓋，把細(xì)胞轉(zhuǎn)入含有4mL培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，然后把培養(yǎng)瓶移至培養(yǎng)箱，36℃～38℃培養(yǎng)1h，讓細(xì)胞貼壁。
④細(xì)胞貼壁后，小心移棄培養(yǎng)基，主要是去掉DMSO(懸浮生長細(xì)胞要通過離心沉淀除去DMSO)、死細(xì)胞及其碎片，加5mL新鮮培養(yǎng)基，36℃～38℃培養(yǎng)。
⑤細(xì)胞培養(yǎng)24h后，更換新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)直到形成單層，便可以傳代。
⑥詳細(xì)記錄復(fù)蘇細(xì)胞的名稱、數(shù)量、復(fù)蘇時間、存放部位等。
注意事項：
1、注意無菌操作。
2、應(yīng)在1-2min內(nèi)使凍存液完全融化。如果復(fù)溫速度太慢，則會造成細(xì)胞損傷。另外，細(xì)胞復(fù)蘇后的操作最好在4℃冰浴中進(jìn)行，以減少冷凍保護(hù)劑對細(xì)胞的毒性。
3、細(xì)胞復(fù)蘇過程中，升溫的速率要大，把從液氮或-70℃冰箱中取出的細(xì)胞在最短的時間內(nèi)放入水浴鍋。
4、細(xì)胞放入水浴中注意用鑷子夾住細(xì)胞凍存管并在水浴中不時晃動，使其受熱均勻，并防止水浴時水進(jìn)入細(xì)胞凍存管污染細(xì)胞。打開細(xì)胞凍存管之前要用酒精棉球?qū)龃婀芟静⒘栏伞?/span>
5、液氮操作有一定的危險性，打開液氮罐取出細(xì)胞時，戴上防護(hù)眼鏡。
6、如果凍存管密封不嚴(yán)，液氮可被吸入。由于解凍時凍存管中的氣溫急劇上升，將可能發(fā)生爆炸。復(fù)蘇過程中應(yīng)蓋上恒溫水浴鍋的蓋。
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