真菌染色——六胺銀法

簡介

六胺銀染色又稱（Periodic-acid silver methenamine）PASM 染色。標本經高碘酸氧化后，使真菌和其他機會性生物的細胞壁內的粘多糖暴露出醛基，醛基將六胺銀還原為黑色的金屬銀。硫代硫酸鈉對已顯色的銀鹽起固定作用，并除去未反應的銀離子。

原理

用高碘酸與組織發生氧化，使組織的基底膜或真菌內的粘多糖暴露醛基，醛基與六胺銀發生作用，將其還原成黑色的金屬銀，再利用硫代硫酸鈉除去未反應的銀離子。

用途

主要用于組織基底膜和真菌（主要應用于新型隱球菌、毛霉菌、曲霉菌、組織胞漿菌、馬爾尼菲青霉菌、放線菌等）的染色。

材料與儀器

① 5% 硼砂水溶液：硼砂 5 克，溶解于 100 毫升的蒸餾水中

② 5% 硝酸銀水溶液：硝酸銀 5 克，溶解于 100 毫升的蒸餾水中

③ 3% 烏洛托品水溶液：烏洛托品 3 克，溶解于 100 毫升的蒸餾水中

④ 六胺銀貯備液：3% 烏洛托品水溶液倒入 5% 的硝酸銀液中，產生白色沉淀，搖蕩變清亮，4 ℃ 避光保存，可保存約 6 個月。

⑤ 應用液：取貯備液 25 毫升，回至室溫，加 5% 硼砂水溶液 5 毫升，現用現配

⑥ 5% 鉻酸水溶液：鉻酸（chromic acid）5 克，蒸餾水 100 毫升

⑦ 1% 亞硫酸氫鈉水溶液：亞硫酸氫鈉（Sodium bisulfite）1 克，蒸水 100 毫升

⑧ 0.05% 淡綠染液：淡綠 0.1 克，蒸餾水 200 毫升，醋酸 0.1 毫升

⑨ 0.1% 氯化金水溶液：氯化金 0.1 克，溶解于 100 毫升的蒸餾水中

⑩ 3% 硫代硫酸鈉水溶液：硫代硫酸鈉 3 克，溶解于 100 毫升的蒸餾水中

步驟

1、切片常規脫蠟至水洗。

2、然后將切片放入 5% 鉻酸水溶液 1小時，自來水沖洗 5 分鐘。

3、隨后將切片放入 1% 亞硫酸氫鈉30分鐘，自來水沖洗 3 分鐘，蒸餾水充分洗滌。

4、六胺銀應用液首先預熱至 60 °C，然后將切片放入配制好的預熱的六胺銀工作液中 1 小時，切片呈淡黃色即取出經水洗后顯微鏡觀察有否有菌體出現。

如有淡棕色菌體出現，應每隔 5~10 min 觀察一次以控制菌體著色深淺，直至顯色理想。隨后蒸餾水洗 5~6 次。

5、再將切片放入 0.1% 氯化金水溶液調色 4 分鐘，蒸餾水洗 1~2 分鐘。

6、隨后將切片放入 3% 硫代硫酸鈉水溶液 5 分鐘。

7、自來水洗 1 分鐘，蒸餾水洗 1 分鐘。

8、淡綠復染 20 秒，流水沖洗 20~60 秒。

9、95% 酒精和無水精脫水，二甲苯透明，樹膠封片。

10、染色結果：真菌黑色，背景淺綠色。

注意事項

1、挑取樣本制成涂片，涂片時必須注意細心操作，涂片薄而均勻。制備的涂片應自然干燥，若采取加熱固定，固定溫度不宜過高，以玻片背面接觸手背不燙為準，否則可能使標本的形態改變影響觀察結果。

2、氯化金調色時，一定要在顯微鏡下觀察。

3、實驗中所用玻璃器皿，應預先用硫酸洗液浸泡并用蒸餾水沖洗干凈，烤干。