傳代細胞培養實驗（基本方法一）

原理

當原代培養成功以后，隨著培養時間的延長和細胞不斷分裂，一方面細胞之間相互接觸而發生接觸性抑制，生長速度減慢甚至停止；另一方面培養基內的營養物不足和代謝物積累不利于細胞生長甚至發生中毒，如果不及時的減少細胞密度，細胞將逐漸衰老死亡。因此需要將培養物按照比例重新接種到新的培養器皿（瓶）內進行培養，這個過程就稱為傳代培養。貼壁培養細胞的傳代通常是采用胰蛋白酶消化把細胞分散成單細胞再傳代，而懸浮型生長細胞的傳代則用直接傳代法或離心法傳代。細胞種類不同，所需的培養基、添加劑以及傳代培養的操作都會有所不同，可以參照 ATCC（美國模式培養物集存庫．http://www.atcc. org）網站上列出的相關信息來操作細胞。

材料與儀器

試劑：細胞 Hanks、胰蛋白酶 EDTA

儀器：培養液吸管、培養瓶

步驟

一、貼壁細胞：HeLa 細胞的傳代培養 

1. 選取生長密度 80% 左右的 HeLa 細胞，在生物安全柜中操作，吸去培養皿中的舊培養基，加入 2 mL 的 D-Hanks 溶液，漂洗細胞以除去殘留的血清。

2. 吸去培養皿中的 D-Hanks 溶液，加入 2 mL 0.25% 胰蛋白酶消化液，于 37 ℃ 消化 2～3 min（如消化程度不夠，可延長時間)，倒置顯微鏡下觀察細胞，當大部分細胞變圓時，輕輕吸去酶消化液（如果有較多細胞漂起，需要直接加入完全培養基來終止胰蛋白酶的消化反應）。 

3. 加入 4 mL 完全培養基，用移液管反復吹打細胞成為細胞懸液。將細胞懸液轉移到 15 mL 離心管中，1000 rpm 離心 5 min。 

4. 輕輕吸去上清后用完全培養基重懸細胞，把細胞懸液一分為二或者一分為三后分別轉移到新的培養皿中。 

5. 接種好的細胞，應在培養皿上標記上細胞名稱、本次傳代日期和操作人，輕輕搖勻后轉移到 CO2 培養箱中于 37 ℃ 培養。 

6. 細胞培養 24 h 后，根據培養基的顏色及細胞的生長密度進行相應的操作（更換新鮮培養基或者再次傳代處理）。 

二、懸浮細胞或半貼壁細胞的傳代培養：

懸浮細胞不貼壁（半貼壁細胞貼壁不緊），所以不需要借助胰蛋白酶消化，具體過程如下： 

1. 取狀態良好的細胞，在生物安全柜中操作，用移液管把細胞吹打均勻。 

2. 把細胞懸液轉移到 15 mL 離心管中，1000 rpm 離心 5 min。 

3. 輕輕吸去上清后用完全培養基重懸細胞，把細胞懸液一分為二或者一分為三后分別轉移到新的培養皿中。 

4. 接種好的細胞，應在培養皿上標記上細胞名稱、本次傳代日期和操作人．輕輕搖勻后轉移到 CO2 培養箱中于 37 ℃ 培養。 

5. 細胞培養 24 h 后，根據培養基的顏色及細胞的生長密度進行相應的操作（更換新鮮培養基或者再次傳代處理）。

注意事項

1. 把握發了傳代時機，已如前述，在 80%~90% 匯合階段最好，過早傳代細胞產量少，過晚細胞健康狀態不佳。 

2. 消化時間要適度，過短細胞不易從瓶壁脫落，過長細胞可脫落流失。

3. 消化液濃度要適宜，過濃時消化作用強烈，細胞反應快，所需消化時間短，掌握不好，細胞易流失。

4. 各種細胞對消化反應不同，有的敏感，有的遲鈍，因此應根據所用細胞特點制定適宜消化措施。有的細胞附著瓶壁不牢，用吸管可從瓶壁直接吹下來，但這樣容易傷害細胞，細胞大片脫落掉，不易計數，應盡可能采用消化法分散細胞為妥。

5. 消化傳代良好時，細胞受損害少，細胞懸液均勻，各分裝樣品中數量誤差小，細胞生長增殖速度一致，實驗結果可靠性大。