蛋黃蛋白肽納米顆粒對姜黃素的包埋與遞送特性
姜黃素（Cur）是一種主要存在于姜黃屬植物根莖中的天然二酮類化合物，具有多種生理功能，被廣泛用于功能性食品的開發。Cur的溶解性較差，很難被小腸上皮細胞直接吸收，且其疏水性會導致其被外排系統排出，難以發揮應有的藥理效應。由于蛋白基納米顆粒無毒、可生物降解以及良好的生物相容性，被公認為是一種理想的遞送系統。蛋黃富含蛋白質和磷脂等活性物質，具有優良的油-水界面吸附能力和乳狀液的抗聚結能力，促使其廣泛應用于蛋黃醬、沙拉醬和烘焙食品中。工業萃取脫磷脂和蛋黃油之后剩下的脫脂蛋黃粉蛋白含量較高，質量分數在50%～80%之間，但功能性質極差，幾乎不溶于水，無法直接應用于食品工業。
近日，華南理工大學食品科學與工程學院的在前期研究基礎上，本研究繼續利用胰蛋白酶水解脫脂蛋黃粉，得到的兩親性EYP在水相中可通過疏水相互作用自組裝成EYP膠束狀納米顆粒（EYPNs），通過調節pH值控制EYPNs的自組裝行為，進而構建EYPNs復合Cur納米顆粒輸送體系，以期擴大脫脂蛋黃粉在功能性納米膠體領域的應用范圍。
1 EYPNs-Cur的結構表征
通過pH值誘導共組裝的方法自下而上制備EYPNs-Cur，制備工藝環保、簡單，未使用有機溶劑，且無需復雜的分離過程。通過將EYPNs溶液pH值調至12.0，促使EYPNs解離并使Cur實現足夠程度的質子化，增加其溶解度，再將pH值回調至7.0，誘導EYPNs重新自組裝形成膠束，從而封裝Cur。隨著EYPNs添加量的增加，溶液顏色逐漸變深，表明Cur被包封的量不斷提高。在中性水溶液中，Cur的溶解度很低，經測定僅為0.13 μg/mL，EYPNs具有較強增溶Cur的能力，當EYPNs質量分數為0.5%時，Cur溶解度（50 μg/mL）明顯提升。隨著EYPNs質量分數的進一步增加（0.5%～4.0%），Cur的包埋率和溶解度不斷升高；當EYPNs質量分數為4.0%時，Cur溶解度（434.35 μg/mL）與對照樣相比提高了3 339 倍，且溶液呈均一、分散狀態。一般而言，較小的粒徑和絕對值較高的Zeta電位意味膠體穩定性較高。水中游離的Cur粒徑呈雙峰分布，粒徑分別為幾百納米到幾微米，這表明Cur在水中的存在形式為不均勻的聚集體；并且Cur的Zeta電位僅為－6.9 mV，說明游離Cur在水相中極不穩定。而EYPNs-Cur的粒徑分布均為單峰，平均粒徑為106.9～126.0 nm，Zeta電位為－20 mV左右。綜上，通過EYPNs自組裝形成的EYPNs-Cur具有優異的溶解度和膠體分散性。
游離Cur聚集成大的片狀結構，這是由于游離的Cur在水中幾乎不溶解，以聚集體形式存在；EYPNs-Cur呈球狀結構，平均粒徑約為120 nm，和納米粒度儀測定結果基本一致，但也出現了少量不規則聚集，造成粒徑變大，很有可能是由于自然風干過程引發EYPNs-Cur出現輕微的聚集。AFM顯示出類似的結果，在游離Cur中觀察到大量微米級聚集體，這也是游離Cur粒徑測定時出現雙峰的原因，EYPNs-Cur復合物則呈類似于球形的納米結構且分布相對均勻。
凍干后的樣品FE-SEM圖像，游離Cur凍干后進一步聚集，形成較為致密的蜂窩狀結構，出現大量不規則棒塊狀顆粒，EYPNs-Cur凍干后結構相對松散，能觀察到大量球狀納米顆粒，同時有大塊片狀結構出現，可能是由于冷凍干燥過程造成部分納米顆粒結構的改變。
2 EYPNs和Cur的相互作用分析
蛋白質的內源熒光光譜法是研究水溶液中蛋白質與小分子結合情況的一種方便的方法。不同Cur添加量對EYPNs發射光譜的影響。不添加Cur的純EYPNs溶液中，在280 nm波長處被激發后，在350 nm波長處出現了一個較高強度的熒光光譜峰。加入少量Cur（10 μg/mL）后，EYPNs的熒光強度即出現大幅減弱，隨著Cur質量濃度（10～40 μg/mL）的進一步增加，EYPNs的熒光強度逐漸減弱并逐漸猝滅，最大發射波長變化不大，這說明Cur分子通過疏水相互作用與EYPNs結合，但對于其所處的微環境無明顯影響。Cur誘導EYPNs的熒光猝滅屬于靜態猝滅。
XRD被廣泛應用于活性物質包埋體系或生物聚合物結晶度的研究。由游離Cur是高度結晶結構，EYPNs為無定形結構。經過簡單的物理混合后，Cur的結晶峰強度有所減弱，但是大部分衍射峰并沒有消失，這可能是由于EYPNs會掩蓋部分Cur造成其衍射峰強度降低；EYPNs-Cur的XRD光譜未顯示任何衍射峰，與EYPNs幾乎完全一致，表明Cur被EYPNs完全封裝。游離Cur在3 510 cm－1處出現的特征吸收峰，對應于Cur中酚羥基（—OH）的拉伸振動。物理混合后Cur的多處特征峰（3 510、1 628、870、710 cm－1）有所減弱但是并沒有消失，這可能是因為EYPNs具有較高的峰形，會掩蓋部分Cur的指紋區使其特征峰強度降低，這表明物理混合并不會使EYPNs與Cur發生相互作用。EYPNs-Cur在3 510 cm－1處的—OH拉伸振動峰消失，說明Cur和EYPNs之間可能存在氫鍵相互作用。Cur分子在1 427、1 154 cm－1和855 cm－1處的特征峰主要與芳香環和環間鏈的振動有關，Cur指紋圖譜區域（500～1 300 cm－1）吸收峰的強度和數量在EYPNs-Cur中均出現明顯降低，表明Cur的疏水基團可能通過疏水相互作用與蛋白質相互作用。此外，Cur-EYPNs與EYPNs的峰形完全一致，這表明Cur與EYPNs通過非共價相互作用結合后完全被封裝起來。
3 EYPNs-Cur的儲存穩定性
在25 ℃下貯藏1 個月的過程中，EYPNs質量分數為0.5%和1.0%時，EYPNs-Curs的粒徑基本不變，2.0%和3.0% EYPNs組的粒徑略微增加，而4.0% EYPNs組的粒徑快速增加，且在結束時增至0 d時的約2 倍。PDI結果顯示，除了4.0% EYPNs組增大至0.417，其他樣品都小于0.3，表明樣品具有較為均一的粒徑分布。所有樣品經儲存1 個月后外觀無明顯變化，未發生聚集和沉淀，只有4.0% EYPNs組的樣品顏色輕微變淺。以上結果表明，除4.0% EYPN組的復合納米顆粒發生了輕微聚集外，其他樣品都顯示出良好的膠體穩定性。
4 EYPNs-Cur的凍干復溶性
Cur在水溶液中的穩定性較差，短時間內會迅速發生降解，并呈pH值依賴性：在pH值為3.0～6.5時，Cur的半衰期為100～200 min；在pH值為7.2～8.0時，Cur的半衰期急劇縮短至1～9 min。因此，評價Cur在儲存期間的保留率至關重要。Cur封裝于EYPNs中大大提高了其降解穩定性。在25 ℃下不避光貯藏1 個月后，EYPNs-Cur中的Cur含量基本未發生改變，只在3.0%、4.0% EYPNs組出現了Cur輕微降解（溶解度分別為322.25～288.00、434.35～393.25 μg/mL）的情況，但其Cur保留量依然高達90%左右。這主要是由于當EYPNs荷載的Cur量較大時，在25 ℃透明玻璃瓶中不可避免地受光照的影響使部分Cur發生降解。本研究中構建的EYPNs-Cur可以有效保護Cur免受光照和氧化劑等的影響而降解。可能的穩定機制如下：一方面歸因于兩親性EYP自身具有一定的抗氧化能力；另一方面，EYPNs與Cur相互作用所結合，起到了“固定”Cur的作用，降低其遷移率，從而降低了其化學反應性；此外，結合XRD結果，Cur被完全封裝于EYPNs的膠束內部，形成了物理屏障，從而保護Cur不被降解。
在室溫25 ℃不避光條件下，EYPNs-Cur已經顯示出良好的儲存穩定性，但較高濃度納米顆粒的粒徑會有所增加，為了更好地實現納米顆粒的長期穩定，進一步考察低溫貯藏條件下EYPNs-Cur的粒徑分布及Cur溶解度變化情況，結果如圖5所示。所有樣品在4 ℃下貯藏1 個月后，粒徑均無明顯變化，范圍為105～135 nm，且PDI變化也很小，PDI最高不超過0.24，這表明在低溫條件下儲存，所有樣品都具有優異的膠體穩定性。此外，EYPNs-Cur的外觀在儲存1 個月后與第1天相比無肉眼可見的差異。所有復合納米顆粒的Cur幾乎沒有發生降解，表明低溫貯藏能有效抑制Cur的降解，這主要是由于低溫可以抑制復合納米顆粒奧斯瓦爾德熟化過程和降低Cur的氧化速率。
5 EYPNs-Cur的凍干復溶性
本實驗考察了凍干后EYPNs-Cur的粒徑分布和Cur溶解性情況，以評估EYPNs-Cur的凍干穩定性。與凍干前相比，復溶后的EYPNs-Cur溶液外觀無明顯變化，整體均一澄清，無肉眼可見的聚集、沉淀出現，呈現出良好的再分散性，且同一EYPNs質量分數組的樣品復溶后的溶解性與凍干前無明顯差異。粒徑分布的結果也與凍干前基本一致，這表明凍干過程對復合納米顆粒的膠體分散性沒有明顯影響，未引發不可逆的顆粒聚集。因此，本研究制備的EYPNs-Cur可適用于多種應用場景，并且具有保存和運輸條件上的優勢。
6 EYPNs-Cur的生物可及性
在消化過程中脂溶性物質經過膽酸鹽乳化后，可形成穩定的復合膠束并通過小腸細胞屏障進而轉運到血液循環中參與多種生命活動。Cur的生物可及性主要取決于其在消化液中的溶解性，Cur含量越高表示其生物可及性越高。游離Cur和EYPNs-Cur在整個模擬消化過程中Cur保有量的變化，在模擬胃消化階段，游離Cur和復合納米顆粒在消化液中的生物可及性均較低，分別為0.3%～0.6%和4.4%～4.9%，雖然在數值上并不高，但EYPNs-Cur卻顯著高于游離Cur。在模擬腸消化階段，兩組樣品在消化液中的Cur保有量均增大，游離Cur和EYPNs-Cur中的Cur生物可及性分別為30.2%～40.9%和66.3%～73.6%。相較于游離Cur，自組裝形成EYPNs-Cur后，Cur的生物可及性提高近1 倍，這表明EYPNs-Cur可以顯著提高Cur的生物可及性。值得注意的是，EYPNs-Cur在模擬消化過程中依然有約30%的Cur未得到利用，原因可能是EYPNs在長達1 h酸性條件下發生聚集并導致復合納米顆粒沉淀。此外，胃蛋白酶也會水解部分EYPNs使EYPNs-Cur失穩并釋放部分Cur，而Cur在酸性環境中溶解性較差。整體來看，將Cur包載于EYPNs中能大幅提升其在消化液中，增加其生物可及性。就EYPNs-Cur而言，如果采用特定的材料封裝讓其安全穿過胃并進入腸道內釋放，其生物可及性將會大幅度提高。
7 結 論
本研究采用工業生產蛋黃卵磷脂和蛋黃油產生的副產物脫脂蛋黃蛋白粉為原料，通過胰蛋白酶水解得到兩親性EYP及其自組裝形成的膠束狀納米顆粒（EYPNs），用于構建穩定的共組裝EYPNs-Cur復合納米顆粒輸送體系。結果表明，EYPNs和Cur之間存在較強的疏水相互作用，Cur通過與EYPNs共組裝形成納米顆粒對Cur進行包埋，可使Cur溶解度大幅提高，同時使其即使經過長達1 個月的不避光貯藏也不發生降解。此外，Cur與EYPN共組裝后的體外消化生物可及性大幅提高，由30.2%～40.9%增加至66.3%～73.6%。本研究表明，由兼具生物活性與兩親性的EYP自組裝形成的納米膠束顆粒是一種新型高效的納米遞送載體，可大幅提升疏水性功能因子的水溶性、穩定性和生物可及性，在功能性食品與營養品以及生物醫藥等領域具有重要的應用價值。
