體外消化對β-胡蘿卜素大豆分離蛋白納米顆粒黏液層滲透及跨膜轉運
蛋白質納米載體已被證實能夠有效改善脂溶性營養素（例如β-胡蘿卜素（BC））的生物利用率。然而，由于嚴苛的胃腸道環境、腸道黏液層屏障以及小腸上皮的跨膜限制，納米載體的口服遞送效果仍受到質疑。大豆分離蛋白（SPI）基納米顆粒被認為是包載BC的理想載體，具有良好的生物相容性和可再生性。本課題組先前的研究發現，在經口吸收過程中，蛋白質載體容易受到極端胃腸條件的影響，界面蛋白發生水解，使得BC的疏水內核暴露于水相中；同時，腸液中的膽鹽、磷脂等小分子活性劑會吸附到疏水內核表面，對BC進行再包埋，形成由蛋白水解肽、膽鹽、磷脂、BC內核共同組成的尺寸在100 nm以下的重構載體。盡管這類重構載體在胃腸道中的穩定性較差，但在小鼠血漿中顯示出良好的轉運吸收效率。
近日，江南大學食品學院研究團隊構建載有BC的SPI納米顆粒，通過透射電子顯微鏡（TEM）、納米粒度儀和高效液相色譜（HPLC）儀對納米載體的形貌、粒度以及包封率等基本性質進行考察。進一步地，通過構建體外模擬消化模型，獲取消化后的重構納米載體，并對其基本結構特性進行分析。最后，采用人體結腸癌細胞系（Caco2）的分化模型與HT29細胞系共培養，模擬小腸上皮細胞的黏液層和緊密細胞膜結構，以評估消化后重構納米載體在黏液層中的滲透性以及在小腸上皮細胞中的轉運效率和轉運模式。旨在探討消化過程對蛋白質納米載體結構的影響以及重構納米載體突破黏液層和跨膜轉運雙重吸收屏障的能力及可能機制，以期為進一步明確納米載體口服遞送的有效性提供實驗依據。
1 BC-SPIs結構性表征
SPIs的多分散系數（PDI）為0.39，粒徑分布較為均一，其電位低于－20 mV，表明其顆粒穩定性較高。包封BC后，平均粒徑較包封前有所增大，可能是因為BC被包埋進入到顆粒內部，使顆粒膨脹。BC-SPIs電位的絕對值較包封前有所提高，說明載入BC后納米顆粒整體穩定性有了進一步提高。BC-SPIs中BC的包封率為40.21%。
使用TEM進一步觀察BC-SPIs的形貌結構。BC-SPIs形態呈球形顆粒。比較發現，利用納米粒度及Zeta電位分析儀測得的BC-SPIs平均粒徑比TEM圖像中觀察到的更大，這是因為TEM觀察的是干燥狀態下的顆粒形貌，而米粒度及Zeta電位分析測量的是顆粒在溶液中的尺寸。在水溶液中，顆粒的表面存在水化層，在TEM干燥制樣的過程中，水分蒸發會破壞水化層，使顆粒失水皺縮，導致尺寸變小。
2 BC-SPIs在消化過程中的結構特性變化
2.1 消化過程中BC-SPIs的粒徑變化
在SIF消化的整個過程中，BC-SPIs粒徑逐漸增大，這是因為SIF消化液中存在的胰蛋白酶使BC-SPIs界面蛋白上的賴氨酸殘基、精氨酸殘基等被切斷，界面蛋白層被破壞，使疏水基團暴露，分子發生聚集，形成大的聚集體，導致粒徑上升，并在隨后的消化過程中結構繼續展開，使顆粒不斷聚集，粒徑持續增大。同時，BC-SPIs在與SIF消化液混合0 min時的粒徑明顯增大，這是因為消化液的高離子濃度造成納米顆粒表面電荷降低，從而發生了顆粒的部分聚集。
2.2 消化過程中BC-SPIs的界面蛋白組成、Zeta電位及其膽鹽吸附情況
在SIF消化的過程中，BC-SPIs的界面蛋白在消化的前5 min內，蛋白條帶密度明顯下降，降解后的條帶主要集中在分子質量低于37 kDa的區域內，印證了2.2.1節中顆粒粒徑的增大。消化后的蛋白水解產物易與膽鹽發生疏水相互作用，結合水相中的游離膽鹽，而帶不同負電的膽鹽在顆粒表面的吸附會改變顆粒的表面電荷。經過SIF消化后，BC-SPIs的表面Zeta電位絕對值增加，電位變化越大，說明界面蛋白被膽鹽取代的程度越高。通過透析法測定了消化后膽鹽在BC-SPIs表面上的吸附情況，結果表明消化液中有56.37%的膽鹽吸附于BC-SPIs消化2 h后的顆粒表面。
3 消化前后BC-SPIs的黏液層滲透及細胞跨膜轉運的考察結果
3.1 利用Caco2單層細胞模轉運模型考察的結果
3.1.1 細胞跨膜電阻和熒光素鈉滲透性
細胞跨膜電阻反映的是細胞模型在分化時細胞間連接的緊密程度，可用于表征細胞膜的完整性，電阻高于250 Ω·cm2代表細胞膜緊密程度良好。Caco2細胞模型在培養分化21 d后跨膜電阻達到890.44 Ω·cm2，說明細胞膜緊密程度高，適用于吸收轉運實驗。
熒光素鈉（分子質量為376 Da）滲透性可用以表征單層細胞膜的緊密連接程度。在前15 min內就已有大量熒光素鈉穿透空白膜（對照），而Caco2細胞模型在孵育4 h后也僅有2.59%的熒光素鈉通過細胞膜，說明細胞膜致密程度良好。
3.1.2 細胞膜的分化程度
除了單層膜的緊密程度和完整性，其頂端功能酶系的發育程度也是考察單層膜是否適合評價化合物轉運吸收的另一項重要指標。在孵育分化過程中，Caco2單層細胞膜AP端酶系會逐漸成熟，直至酶活力不變。盡管平行樣品間酶活力的基礎值有所差異，但由于BL端的酶活力在孵育期間相對穩定，故可用AP端與BL端ALP活力的比值（AP/BL比值）來評價單層細胞膜的分化程度。如圖5所示，在培養分化的過程中，AP/BL比值隨著培養時間的延長逐漸增加，在19 d時達到比較穩定的狀態，表明單層細胞膜頂端酶系的生長已經成熟，頂端酶系不再發生變化。
3.1.3 BC-SPIs細胞毒性考察
Narain等報道膽鹽分子在胃腸道中作為陰離子表面活性劑，某些濃度下會表現出細胞毒性，說明消化液中膽鹽的存在會提高消化產物的細胞毒性，而本實驗消化后樣品中含有游離的膽鹽分子，因此有必要先進行安全實驗再進行后續實驗。以細胞存活率不低于75%作為標準，確定未被消化的BC-SPIs安全的最低稀釋倍數為5 倍，消化后產物安全的最低稀釋倍數為10 倍。消化液中BC質量濃度經HPLC定量為44 μg/mL，根據消化后產物的安全稀釋倍數確定Caco2細胞模型中BC最高添加量為4.4 μg/mL。
3.2 利用Caco2-HT29共培養細胞模型的考察結果
3.2.1 細胞跨膜電阻和熒光素鈉滲透性
Caco2/HT29共培養的細胞模型在21 d后細胞跨膜電阻為720.44 Ω·cm2，低于Caco2細胞跨膜電阻。這是因為Caco2細胞之間能非常緊密地連接，而HT29細胞會改變細胞的連接程度導致跨膜電阻降低。Caco2/HT29細胞跨膜電阻大于130 Ω·cm2，被認為細胞單層連接較為緊密，能夠形成致密的單層細胞模型。
Caco2/HT29共培養細胞模型在孵育4 h后，僅有3.38%的熒光素鈉通過細胞膜，遠低于空白的聚碳酸酯膜（對照），這說明經過Caco2/HT29共培養細胞模型細胞膜致密，可用于后續研究。
3.2.2 細胞膜頂端ALP活力
在21 d的培養過程中，AP/BL比值在17 d時達到穩定，表明在共培養細胞模型的頂端酶系已經成熟，未受到黏液層的影響。
3.2.3 黏液層染色實驗結果
為了確認HT29細胞在共培養細胞模型黏液層中的形成，使用阿利新藍對不同生長階段的單層細胞表面進行染色。Caco2細胞中只能檢測到極為少量的黏蛋白。而對于HT29細胞，無論是單獨培養還是和Caco2細胞共培養，都可以分泌大量的黏蛋白。在HT29細胞單獨培養時，培養14 d時黏液的分布就已經很均勻，而共培養模型則在21 d時黏液量最多，形成了含有黏液層的小腸上皮細胞跨膜模型。
3.2.4 BC-SPIs細胞毒性考察
其結果與Caco2細胞毒性實驗結果一致，以細胞存活率不低于75%作為標準，確定未被消化的BC-SPIs安全的最低稀釋倍數為5，消化后產物安全的最低稀釋倍數為10。最終確定后續實驗時Caco2-HT29共培養模型中的BC添加量統一為4.4 μg/mL。
3.3 利用Caco2-HT29共培養細胞對BC-SPIs的吸收、轉運效率考察結果
3.3.1 BC-SPIs的細胞吸收
細胞內BC的代謝產物主要是視黃醇和視黃醇棕櫚酸酯，而維生素A酸和BC只占很少一部分。消化后BC-SPIs在Caco2-HT29共培養細胞內的BC及其代謝產物積累量顯著高于消化前顆粒。2.2.2節中已證實BC-SPIs在消化后表面上吸附了大量的膽鹽分子。有研究表明膽鹽修飾可以通過降低腸道黏液層的黏度和彈性促進顆粒的黏液層滲透性；同時有研究表明，還可通過增強生物膜流動性和通透性、降低細胞間緊密連接程度、抑制其外排作用等特性促進攜帶營養素的納米顆粒在小腸上皮細胞膜的吸收。
3.3.2 BC-SPIs的轉運
消化前后的BC-SPIs在Caco2-HT29共培養模型中的轉運情況，整體來看，經過細胞代謝進入體循環的BC及其代謝產物的分布規律與細胞中積累的規律基本一致，代謝產物仍主要為視黃醇和視黃醇棕櫚酸酯。對比未被消化的BC-SPIs，消化后在細胞中以及BL端檢測到的BC及其代謝產物更多。上述研究結果表明BC-SPIs在消化過程中發生的結構轉化改善了轉運吸收效率，一方面可能是因為膽鹽在顆粒表面的吸附突破了黏液層屏障，增加了顆粒的黏液層滲透性；另一方面也可能是因顆粒結構改變引起轉運模式的變化，從而提高了其轉運效率。為了驗證上述假設，通過后續實驗進行了進一步考察。
3.4 消化前后BC-SPIs的黏液層滲透性及轉運模式的考察結果
3.4.1 消化前后BC-SPIs的黏液層滲透性
為進一步探究消化改善BC-SPIs轉運吸收特性的機制，分別對消化前后BC-SPIs的黏液層滲透性和跨膜轉運模式進行考察。盡管BC-SPIs在消化后具有更大的粒徑和更多的負電荷，但能夠穿透細胞模型黏液層的整體VA當量較消化前有所增加。負電荷數量的增加和尺寸的增大會阻礙顆粒在黏液層中的遷移，而膽鹽吸附則能增強顆粒在黏液層的滲透性，綜合來看，表面膽鹽的修飾作用要大于表面電荷和粒徑變化帶來的影響。結合所述BC及其代謝產物的胞內積累量和轉運量，發現消化后的BC-SPIs跨越黏液層屏障的能力提高了0.48 倍。
3.4.2 消化前后BC-SPIs在Caco2細胞中的吸收、轉運效率
消化后的BC-SPIs除了黏液層滲透性得到了提高，其跨膜吸收量也有所提升。與Caco2/HT29共培養模型對比來看，Caco2細胞中所積累的BC及其代謝產物含量更高，這可能是由于共培養模型中的黏液層會阻礙了BC-SPIs與Caco2細胞的接觸，導致BC-SPIs穿透黏膜層進入到小腸上皮細胞中效率變慢，積累量降低。
與胞內吸收的結果類似，相比Caco2/HT29共培養模型，Caco2模型中所轉運的BC及其代謝產物含量更多，代謝規律趨勢與共培養模型類似。結合表5和表6中所述胞內積累和轉運BC含量，發現消化后的BC-SPIs跨膜轉運量提高了0.56 倍。
3.4.3 消化前后BC-SPIs的單層細胞膜轉運模式
目前的觀點認為大部分BC-SPIs是通過內吞作用進入到細胞內部。內吞作用途徑包括網格蛋白依賴的內吞作用、小窩蛋白依賴的內吞作用、非網格蛋白和小窩蛋白依賴的內吞作用、巨胞飲作用、小窩/脂閥依賴的內吞作用，分別可以通過使用內吞作用抑制劑（氯丙嗪、吲哚美辛、槲皮素、β-環糊精和阿米洛利排除特定的內吞作用，闡釋轉運BC-SPIs的內吞作用機制。
當用不同的抑制劑處理細胞時，細胞對BC-SPIs的相對吸收率有不同程度的降低。與37 ℃正常溫度的轉運相比，細胞轉運在4 ℃時受到明顯的抑制。說明BC-SPIs的轉運方式主要是需要能量的主動內吞作用。使用氯丙嗪和吲哚美辛處理細胞時，BC-SPIs的相對吸收率減少50%左右，說明網格蛋白依賴的內吞作用和小窩蛋白依賴的內吞作用對BC-SPIs的轉運起重要作用。
而當BC-SPIs經過消化后轉運時，不僅是吲哚美辛和氯丙嗪能夠抑制其內吞作用，阿米洛利也顯著影響了顆粒的轉運，說明消化后顆粒的轉運模式主要為網格蛋白依賴的內吞作用、小窩蛋白依賴的內吞作用和巨胞飲作用。
為了進一步明確消化后顆粒轉運模式發生變化的原因，對可能的消化條件影響因素進行了驗證。在4 種消化模式中，僅添加膽鹽促進了小窩蛋白和網格蛋白依賴的內吞作用，并不會引發巨胞飲；而僅添加胰蛋白酶則會促進巨飽飲作用。產生這種差異的原因，可能在于在不同消化條件影響下，BC-SPIs結構產生了不同程度的變化。在消化前，由于BC-SPIs的粒徑（＜200 nm）以及顆粒帶負電的原因，導致細胞轉運納米顆粒的主要方式是網格蛋白以及小窩蛋白依賴的內吞作用。經過消化后，由于胰蛋白酶的作用，顆粒在消化過程中發生絮凝，導致顆粒的粒徑增加，從而促進巨飽飲作用的產生，而膽鹽與顆粒的相互結合導致顆粒帶有更多的負電，影響了小窩蛋白依賴的內吞作用。而在消化前后溶液中都存在200 nm以下的顆粒，因此對網格蛋白依賴的內吞作用影響不大。
4 結 論
BC-SPIs經消化后界面蛋白水解、顆粒尺寸增加，且一定量的膽鹽分子吸附于表面。消化后的顆粒在小腸上皮細胞膜的吸收轉運量較初始顆粒有所增加，一方面是因為表面吸附的膽鹽促進了消化后的顆粒在黏液層的滲透，提高了小腸上皮細胞膜的跨膜轉運量；另一方面則是因為顆粒結構變化帶來的轉運途徑的增加，在小窩蛋白和網格蛋白依賴的內吞作用基礎上，增加了巨胞飲轉運途徑，減少了黏液層和跨膜轉運雙重吸收屏障的限制，促進了細胞對BC的吸收和利用。
