同位素稀釋-液相色譜法測定奶粉中五氯苯酚
五氯苯酚（又名五氯酚）及其鈉鹽五氯酚鈉（又名五氯酚酸鈉）是持久性環境污染物，常用作殺蟲劑，皮革、木材防腐劑，農業除草劑以及吸血蟲中間宿主釘螺的滅殺等。五氯苯酚及其鈉鹽化學性質穩定，難降解，可在環境中擴散傳播和在食物鏈中蓄積，通過環境或食物鏈進入動植物和人體內，當人體內五氯苯酚及其鈉鹽蓄積到一定量后可能會導致內分泌紊亂、致癌、致畸和誘發人體器官病變等。我國國家食品安全監督抽檢實施細則（2019年版）將水產品、畜禽肉及其副產品中五氯苯酚及其鈉鹽作為必檢項目，農業農村部公告第250號規定食品動物中不得檢出五氯苯酚及其鈉鹽。
液相色譜-串聯質譜（LC-MS/MS）法測定五氯苯酚及其鈉鹽無需衍生化，方法簡單、靈敏度高，但容易受到基質抑制作用影響，因此需對樣品進行凈化，QuEChERS法具有簡單、快速、經濟、高效等優點，適用于大批量樣品快速檢測，廣泛應用于食品中農藥殘留和獸藥殘留檢測。
因此，廣東產品質量監督檢驗研究院建立QuEChERS萃取，Captiva EMR-Lipid脂質去除凈化柱凈化，基質匹配-同位素稀釋內標法結合LC-MS/MS法測定奶粉中五氯苯酚的分析方法，縮短樣品前處理時間、簡化樣品前處理過程、降低基質效應、提高大批量樣品的檢測效率，彌補奶粉基質中五氯苯酚檢測方法缺失，以期為開展相關風險監測提供技術支持。
1 質譜方法優化
五氯苯酚分子中氯原子存在35Cl和37Cl同位素，在ESI-下，五氯苯酚和五氯苯酚-13C6分別監測到m/z相差為2的多個母離子（Q1）峰。五氯苯酚母離子質量數分別為262.8、264.8、266.8、268.8、270.8；五氯苯酚-13C6母離子質量數分別為268.8、270.8、272.8、274.8、276.8。對上述各個母離子進行碎裂，均未監測到任何子離子（Q3）碎片，分析其原因可能是五氯苯酚和五氯苯酚-13C6分子結構對稱，共軛性強，結構十分穩定，難以碎裂產生特征子離子碎片。
本實驗選擇離子對m/z 262.8/262.8、264.8/264.8、266.8/266.8、268.8/268.8作為五氯苯酚監測離子，與田春霞等的研究和GB 23200.92—2016一致。通過優化錐孔電壓和碰撞能量后m/z 264.8/264.8響應最高，但實際樣品檢測中發現該離子MRM圖顯示雜峰較多，m/z 262.8/262.8雜峰最少。因此，選擇m/z 262.8/262.8作為定量離子對，其余離子作為定性離子，符合歐盟EC657/2002對串聯三重四極桿質譜進行化合物定性鑒別要求。由于五氯苯酚和內標五氯苯酚-13C6存在相同質量數的母離子m/z 268.8、270.8，為避免干擾定量，五氯苯酚-13C6選擇m/z 272.8/272.8離子對的峰面積參與計算，其余離子作為定性離子。
2 前處理方法選擇與優化
2.1 提取條件優化
本實驗先以5 倍于奶粉質量的水體積充分溶解奶粉，破壞奶粉顆粒，釋放奶粉中可能存在的待測化合物，然后通過酸水解法或堿水解法使可能以結合態形式存在的待測化合物轉化為游離態，再進一步用有機試劑提取，使檢測結果更準確。甲醇或乙腈均可作為提取試劑和蛋白沉淀劑，但乙腈的萃取回收率和蛋白沉淀效果優于甲醇，因此，本實驗選擇乙腈作為提取試劑和蛋白沉淀劑。
為避免同位素稀釋法經內標折算后不能體現方法的回收率差異，除特殊說明外，本實驗涉及的回收率比較均采用基質匹配外標法定量，以此確定最佳的實驗條件，最終形成最優的同位素稀釋樣品前處理方法。
采用空白奶粉樣品添加五氯苯酚5 μg/kg，比較酸水解法和堿水解法的回收率差異。酸水解法是用甲酸替代氫氧化鉀或氫氧化鈉溶液，其余步驟按原文1.3.3節操作；堿水解法完全按1.3.3節操作。結果表明，堿水解法比酸水解法回收率高約25%～35%，且重復性更好。其原因可能是部分五氯苯酚與奶粉中含有羧基（—COOH）或氨基（—NH2）的物質相互作用，形成了結合態，堿水解法可以將結合態、分子態等形式存在的待測化合物充分轉化為易溶于水的五氯苯酚鈉，有利于充分提取，回收率更高，重復性更好；酸水解法對結合態存在的待測化合物作用不明顯，回收率偏低。因此，本實驗選擇堿水解法。
2.2 QuEChERS方法優化
QuEChERS法萃取與固相萃取法相比，更簡單、更高效、成本更低、重復性更好，同時具備萃取和初步凈化樣品作用，避免了固相萃取法步驟繁瑣、耗時長、堵塞柱子以及重復性不穩定等缺點，本實驗優先選擇QuEChERS法萃取，適用于大批量樣品快速檢測。
QuEChERS萃取常用的鹽析試劑有無水硫酸鎂、無水硫酸鈉、乙酸鈉、氯化鈉等。在優化的實驗條件下，比較無水硫酸鎂、無水硫酸鈉、乙酸鈉、氯化鈉對五氯苯酚萃取回收率的影響，以基質匹配外標法定量計算回收率，結果表明，無水硫酸鎂作鹽析試劑時，回收率最高。進一步比較無水硫酸鎂添加量為1、2、3、4 g對回收率的影響。結果表明，當溶解奶粉的水與無水硫酸鎂添加量比例為5∶1（mL/g）時，回收率最佳；當無水硫酸鎂添加量超過該比例時，回收率有所下降，這可能是由于過量無水硫酸鎂加入瞬間局部水分被迅速吸收，形成的顆粒物吸附五氯苯酚。
多次萃取可提高目標化合物的回收率，但前處理耗時長，需要消耗更多有機試劑。本實驗使用同位素稀釋內標法檢測，僅需QuEChERS法萃取一次，回收率達到90%以上，操作簡單、顯著縮短樣品前處理時間，有利于大批量樣品快速檢測。
2.3 樣品凈化
奶粉樣品含有大量蛋白質、約16%脂肪以及約1%～3%磷脂。QuEChERS法同時起到萃取和去除無機鹽、水溶性雜質等凈化作用，但脂肪和磷脂也會被乙腈提取出來，這些雜質對五氯苯酚檢測起基質抑制作用，需進一步凈化。Captiva EMR-Lipid脂質去除凈化柱可同時去除乙腈提取液中脂肪和磷脂，有效降低基質抑制，與GB 23200.92—2016的MAX固相萃取柱凈化相比，整個凈化過程省略了活化、淋洗、洗脫等步驟，簡化凈化流程，直接收集流出液即完成凈化操作，顯著提高前處理效率，且樣品加標絕對回收率比GB 23200.92—2016高約10%～15%，因此，選擇采用Captiva EMR-Lipid脂質去除凈化柱對樣品提取液作進一步凈化。
用空白基質提取液配制相同質量濃度的標準溶液，分別用尼龍66（材質為聚己二酰己二胺）和聚四氟乙烯材質的有機系針式濾頭過濾，比較不同材質濾頭對五氯苯酚的吸附作用。結果表明，尼龍66有機系針式濾頭對五氯苯酚有吸附，五氯苯酚損失約30%～35%；聚四氟乙烯有機系針式濾頭對五氯苯酚無吸附。其原因可能是尼龍66濾膜材質的胺基（—NH—）與五氯苯酚的酚羥基結合，使部分五氯苯酚保留在濾膜上，導致五氯苯酚損失，但將過濾后的濾液用同一個濾頭再過濾一次，損失率下降至10%左右，可能是由于再次過濾能將保留在濾膜上的五氯苯酚洗脫下來；聚四氟乙烯不存在與五氯苯酚發生反應的基團，所以五氯苯酚無損失。因此，選擇使用PTFE材質的有機系針式濾頭過濾。
3 方法學考察
3.1 基質效應
除不加同位素內標外，按照優化的前處理方法對添加五氯苯酚3 μg/kg的奶粉樣品進行6 個平行測定，制得樣品待測液，考察基質效應。分別用乙腈、甲醇、空白基質提取液配制標準工作曲線，分別對樣品待測液進行外標法定量，計算平均回收率。結果表明，以乙腈、甲醇配制的標準工作曲線定量的平均回收率分別為33%、25%；以空白基質提取液配制的標準工作曲線定量（基質匹配外標法定量）的回收率為63%；表明存在較強的基質抑制作用。為降低或消除基質抑制作用，本實驗采用空白基質提取液與同位素稀釋內標法相結合配制標準工作曲線進行定量，平均回收率為90%，有效降低基質抑制作用，使定量結果更加準確、可靠。由于五氯苯酚未能碎裂形成子離子碎片，實際樣品的提取離子色譜圖顯示雜峰較多，采用同位素稀釋內標法可提高定性鑒別準確度。
3.2 線性關系、檢出限和定量限
五氯苯酚的空白基質提取液-同位素稀釋內標標準工作曲線在質量濃度0.2～150 μg/L范圍內，具有良好的線性關系，線性方程為y＝0.24256x+0.04470，相關系數r＝0.9960。以不含五氯苯酚的奶粉樣品添加標準品的方式考察方法檢出限和定量限，分別以定量離子3 倍信噪比和10 倍信噪比響應值對應的含量作為方法檢出限和定量限，方法檢出限和定量限分別為0.5、1.5 μg/kg。在1.3.5節和1.3.6節條件下測定，獲得的基質匹配標準品（10 μg/L）的提取離子色譜圖。
3.3 回收率和精密度
在2 g（精確至0.01 g）不含五氯苯酚的奶粉樣品中分別添加質量濃度為0.1 μg/mL五氯苯酚標準溶液30、60 μL，1 μg/mL五氯苯酚標準溶液30 μL（添加水平分別相當于樣品中五氯苯酚含量為1.5、3.0、15.0 μg/kg），然后在每個樣品中添加100 μL質量濃度為0.5 μg/mL的五氯苯酚-13C6標準溶液，每個添加水平平行測定6 次，空白基質提取液-同位素稀釋內標法定量，考察方法回收率和精密度，結果見表3，平均回收率為90.3%～119.2%，相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）為5.8%～7.5%，回收率和精密度均符合GB/T 27404—2008附錄F之F.1回收率和F.3精密度要求，滿足奶粉中五氯苯酚殘留量檢測要求。1.3.5節和1.3.6節條件下測定，獲得的空白奶粉樣品添加15.0 μg/kg標準品的提取離子色譜圖。
4 實際樣品測定
采用建立的方法對45 批奶粉樣品（嬰幼兒配方奶粉1 段15 批次，2段10 批次，3段10 批次，中老年奶粉10 批次）進行檢測，均未檢出五氯苯酚。
5 結論
本實驗建立QuEChERS萃取，Captiva EMR-Lipid脂質去除凈化柱凈化，基質匹配-同位素稀釋內標法結合LC-MS/MS測定奶粉中五氯苯酚的分析方法。在水浴加熱條件下，采用堿水解法將奶粉中可能以結合態、分子態形式存在的待測化合物充分轉化為易溶于水的五氯苯酚鈉，在乙腈存在條件下，用甲酸將五氯苯酚鈉轉化為不溶于水、易溶于乙腈的五氯苯酚，再以無水硫酸鎂為鹽析試劑的QuEChERS法萃取，用Captiva EMR-Lipid脂質去除凈化柱對樣品提取液作進一步凈化，凈化液與水按1∶1比例混合后，用LC-MS/MS測定，以基質匹配-同位數稀釋內標標準工作曲線法定量，本方法具有操作簡單、快速、回收率高、準確可靠等優點，彌補了奶粉中五氯苯酚殘留量檢測方法缺失，為開展相關風險監測提供技術支持。
