體外蛋白合成新技術(shù)可媲美細(xì)胞中的天然核糖體
許多蛋白作為治療糖尿病、癌癥和關(guān)節(jié)炎等疾病的藥物是有用的。合成這些蛋白的人工版本是一個(gè)耗時(shí)的過(guò)程，需要通過(guò)對(duì)微生物或其他細(xì)胞進(jìn)行基因改造來(lái)產(chǎn)生所需的蛋白。
在一項(xiàng)新的研究中，來(lái)自美國(guó)麻省理工學(xué)院的研究人員開發(fā)出一種新技術(shù)，可以大幅降低產(chǎn)生合成蛋白所需的時(shí)間。他們的臺(tái)式自動(dòng)流動(dòng)合成機(jī)（flow synthesis machine）可以在幾小時(shí)內(nèi)將數(shù)百個(gè)氨基酸連接在一起。他們認(rèn)為，他們的新技術(shù)可能加快按需藥物的制造和新藥的開發(fā)，并允許科學(xué)家通過(guò)加入細(xì)胞中不存在的氨基酸來(lái)設(shè)計(jì)人工蛋白。相關(guān)研究結(jié)果發(fā)表在2020年5月29日的Science期刊上，論文標(biāo)題為“Synthesis of proteins by automated flow chemistry”。
來(lái)自麻省理工學(xué)院的研究人員開發(fā)出一種新的技術(shù)，可快速合成長(zhǎng)達(dá)164個(gè)氨基酸的蛋白鏈。這種基于流動(dòng)化學(xué)的技術(shù)可能加速藥物開發(fā)并使得科學(xué)家們能夠設(shè)計(jì)含有細(xì)胞中非天然存在的氨基酸的蛋白變體。如圖所示，這臺(tái)臺(tái)式自動(dòng)流動(dòng)合成機(jī)被這個(gè)研究團(tuán)隊(duì)稱為“Amidator”。
論文通訊作者、麻省理工學(xué)院化學(xué)副教授Brad Pentelute說(shuō)，“你可以設(shè)計(jì)出具有卓越生物功能的新蛋白變體，這一點(diǎn)可通過(guò)使用非天然氨基酸或特定的修飾來(lái)實(shí)現(xiàn)，當(dāng)你使用自然界的分子儀器制造蛋白時(shí)，這是不可能實(shí)現(xiàn)的?！?/span>
在這篇論文中，這些研究人員表明，他們可以用化學(xué)方法制造出多個(gè)長(zhǎng)達(dá)164個(gè)氨基酸的蛋白鏈，包括酶和生長(zhǎng)因子。對(duì)于這幾種合成蛋白，他們進(jìn)行了詳細(xì)的分析，顯示它們的功能與天然的蛋白對(duì)應(yīng)物相當(dāng)。
快速生產(chǎn)
在人體中發(fā)現(xiàn)的大多數(shù)蛋白長(zhǎng)達(dá)400個(gè)氨基酸。合成大量的這些蛋白需要將所需蛋白的基因遞送到作為活工廠的細(xì)胞中。這個(gè)過(guò)程用于對(duì)細(xì)菌或酵母細(xì)胞進(jìn)行基因改造，以產(chǎn)生胰島素和其他藥物，如生長(zhǎng)激素。
論文共同作者Thomas Nielsen說(shuō)，“這是一個(gè)耗時(shí)的過(guò)程。首先你需要可用的基因，你需要了解一些關(guān)于有機(jī)體細(xì)胞生物學(xué)的知識(shí)，這樣你就可以進(jìn)行基因改造使得你所需的蛋白表達(dá)。”
蛋白產(chǎn)生的另一種方法，最早是由Bruce Merrifield在20世紀(jì)60年代提出的，他后來(lái)因在固相肽合成方面的工作而獲得了諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。這種方法是通過(guò)化學(xué)方法逐步地將氨基酸連接在一起?；罴?xì)胞用來(lái)構(gòu)建蛋白的氨基酸有20種，而利用Merrifield開創(chuàng)的技術(shù)，大約需要一個(gè)小時(shí)的時(shí)間，就能完成將一個(gè)氨基酸添加到肽鏈上所需的化學(xué)反應(yīng)。
Pentelute實(shí)驗(yàn)室發(fā)明了一種更快速的方法來(lái)執(zhí)行這些反應(yīng)，這種方法基于一種稱為流動(dòng)化學(xué)（flow chemistry）的技術(shù)。在他們的機(jī)器中，化學(xué)物通過(guò)機(jī)械泵和閥門進(jìn)行混合，在整個(gè)合成過(guò)程的每一步，化學(xué)物都會(huì)經(jīng)過(guò)一個(gè)包含樹脂床的加熱反應(yīng)器循環(huán)。在這種新研究中優(yōu)化的方案中，形成每個(gè)肽鍵平均需要2.5分鐘，而長(zhǎng)達(dá)25個(gè)氨基酸的肽可以在不到一個(gè)小時(shí)的時(shí)間內(nèi)組裝完成。
在這項(xiàng)技術(shù)開發(fā)出來(lái)之后，制造出多種蛋白藥物的諾和諾德公司開始有興趣與Pentelute實(shí)驗(yàn)室合作，旨在合成更長(zhǎng)的肽和蛋白。為了實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)，這些研究人員需要提高肽鏈中氨基酸之間形成肽鍵的反應(yīng)效率。對(duì)于每個(gè)化學(xué)反應(yīng)，他們之前的效率在95%到98%之間，但對(duì)于更長(zhǎng)的蛋白，這一數(shù)字需要超過(guò)99%。
Pentelute說(shuō)，“我們的理由是，如果我們真地很擅長(zhǎng)制造肽，我們可以將這種技術(shù)擴(kuò)展到制造蛋白。我們的想法是要有一臺(tái)機(jī)器，用戶可以走到它面前并輸入蛋白質(zhì)序列，它將以一種高效的方式將所需的氨基酸串聯(lián)起來(lái)，在一天結(jié)束時(shí)，你可以得到你想要的蛋白。這極其具有挑戰(zhàn)性的，這是因?yàn)槿绻恳徊降幕瘜W(xué)反應(yīng)都沒有接近100%，你將得不到任何想要的材料?！?/span>
為了提高他們的成功率并找到每個(gè)反應(yīng)的最佳配方，這些研究人員在許多不同的條件下進(jìn)行了氨基酸特異性偶聯(lián)反應(yīng)。他們說(shuō)，在這項(xiàng)新的研究中，他們他們制定了一個(gè)通用的方案，使得每個(gè)反應(yīng)的平均效率大于99%，這就確保當(dāng)如此多的氨基酸被連接在一起形成較大的蛋白時(shí)，效果顯著。
Hartrampf說(shuō)，“如果你想制造蛋白，這額外的1%真的會(huì)產(chǎn)生很大的不同，這是因?yàn)楦碑a(chǎn)物會(huì)積累，你需要提高每一個(gè)氨基酸的整合成功率?！?/span>
利用這種方法，這些研究人員能夠合成一種含有164個(gè)氨基酸的蛋白--轉(zhuǎn)肽酶A（sortase A），它是一種細(xì)菌蛋白。他們還制造出具有86個(gè)氨基酸的胰島素前體--胰島素原（proinsulin）、具有129個(gè)氨基酸的溶菌酶，以及其他一些蛋白。所制造出的蛋白必須經(jīng)過(guò)純化，然后折疊成正確的形狀，這使整個(gè)合成過(guò)程多了幾個(gè)小時(shí)。所有純化的合成蛋白都是以毫克級(jí)的數(shù)量獲得的，占整個(gè)產(chǎn)量的1%-5%。
藥物化學(xué)
這些研究人員還測(cè)試了他們制造出的五種合成蛋白的生物學(xué)功能，發(fā)現(xiàn)它們與有機(jī)體天然表達(dá)的蛋白版本的功能相當(dāng)。他們表示，能夠快速產(chǎn)生任何所需的蛋白序列應(yīng)當(dāng)能夠更快地進(jìn)行藥物開發(fā)和測(cè)試。這種新技術(shù)還允許將活細(xì)胞DNA編碼的20個(gè)氨基酸以外的氨基酸整合到蛋白中，從而極大地?cái)U(kuò)展了可能制造出的潛在蛋白藥物的結(jié)構(gòu)和功能多樣性。
Nielsen說(shuō)，“這是在為蛋白藥物化學(xué)的新領(lǐng)域鋪平道路。這種技術(shù)真正補(bǔ)充了現(xiàn)有的制藥行業(yè)，為快速發(fā)現(xiàn)基于肽和蛋白的生物制劑提供了新的機(jī)會(huì)?！?/span>
這些研究人員如今正致力于進(jìn)一步改進(jìn)這種技術(shù)，使得它能夠合成長(zhǎng)達(dá)300個(gè)氨基酸的蛋白鏈。他們還在努力實(shí)現(xiàn)整個(gè)制造過(guò)程的自動(dòng)化，這樣一旦合成好蛋白，切割、純化和折疊等步驟也會(huì)發(fā)生，不需要任何人工干預(yù)。
參考資料：
1.Nina Hartrampf et al. Synthesis of proteins by automated flow chemistry. Science, 2020, doi:10.1126/science.abb2491.
2.Caroline Proulx. Catching up to nature's ribosomes. Science, 2020, doi:10.1126/science.abb9711.
3.New technology enables fast protein synthesis
https://phys.org/news/2020-05-technology-enables-fast-protein-synthesis.html
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