實(shí)驗(yàn)性自身免疫性重癥肌無力(EAMG)模型

原理

1973年P(guān)atrick等首先從電鰻電器官提取純化乙酰膽堿受體(AChR),免疫接種新西蘭大白兔后獲得實(shí)驗(yàn)性自身免疫性重癥肌無力(experimental autoimmune myasthenia gravis,EAMG)模型，可以模擬重癥肌無力。后來在大鼠、小鼠、豚鼠、猴中用同樣方法也制備了EAMG模型。隨著蛋白質(zhì)組織化學(xué)的發(fā)展，現(xiàn)已掌握了人及一些實(shí)驗(yàn)動(dòng)物AChR主要致病區(qū)的肽鏈結(jié)構(gòu)，因此出現(xiàn)了用合成多肽作為免疫原制備EAMG模型的方法。

材料與儀器

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物6-8周雌性Wister大鼠 體重200-250g
免疫原加利福尼亞電鰻AChR-a的146-162序列片段

步驟

(1)免疫原的制備人工合成加利福尼亞電幔AchR-a的146-162序列片段作為免疫原，其氨基酸序列為Ala-Ile-Phe-Lys-Ser-Tyr-Cys-Glu-Ile-Ile-Val-Thr-His-Phe-Pro-Phe-Asp。

(2)模型制備程序?yàn)椋孩賹⒑铣啥嚯?0μg溶解于100μL的PBS緩沖液中(pH7.2),并加入等量的CFA,充分混合，直到水溶液完全被油滴吸附；②皮下注射接種于背部6處（每處20μL)、兩后肢墊（每處20μL)和尾基部(40μL); ③將合成多肽20μg溶解于50μL的PBS緩沖液中(pH7.2)，并加入等量的不完全弗氏佐劑，充分混合；④混合注射于背部3處（每處20μL)和尾基部(40μL)。;

結(jié)果判定：對(duì)于實(shí)驗(yàn)性自身免疫性重癥肌無力動(dòng)物模型來講，單純的癥狀如體重下降，活動(dòng)、進(jìn)食減少、閉目等并無特異性。血清抗體檢查存在抗體陰性和檢出率的問題。動(dòng)物電生理的檢查，存在一些干擾因素，不能排除誤差。因此必須綜合多個(gè)指標(biāo)進(jìn)行分析，其中癥狀、AchR-Ab抗體滴度和電鏡結(jié)果最有意義。

(1)臨床癥狀按照Lennon分級(jí)法將癥狀嚴(yán)重程度分為：

①0級(jí)沒有肯定的無力表現(xiàn)；②1級(jí)撕咬無力，四肢力量較差，在光滑地面上前肢打滑，活動(dòng)減少且易疲勞；③2級(jí)明顯無力，休息時(shí)身體呈隆起姿勢(shì)，頭尾下垂，大腿外展，前肢（趾）彎曲，動(dòng)作笨拙，步態(tài)不穩(wěn)；④3級(jí)嚴(yán)重?zé)o力表現(xiàn)，無撕咬動(dòng)作，肌肉震顫，呼吸困難，瀕死或死亡。癥狀居于中間者，分別評(píng)為0.5、1.5和2.5級(jí)。每天按照以上標(biāo)準(zhǔn)觀察并記錄癥狀變化。

(2)電生理檢查用水合氯醛溶液將小鼠麻醉后固定在木板上，將成對(duì)刺激電極以2-3mm距離插至坐骨切跡附近肌肉內(nèi)，記錄電極置于胖腸肌內(nèi)側(cè)頭（跟腿附著處），重復(fù)用50-100Hz電刺激，并記錄小鼠排腸肌電位及收縮波幅。成功模型可見重復(fù)神經(jīng)電刺激呈衰減反應(yīng)。

(3)電鏡檢查通常將小鼠斷頸法處死，在解剖顯微鏡下沿坐骨神經(jīng)分離組織，于腓腸肌終末分支處迅速取其排腸肌組織進(jìn)行透射電鏡觀察。成功模型大鼠神經(jīng)肌肉接頭褶局部紊亂、溶解、消失，突觸前膜囊泡減少，線粒體等細(xì)胞器空泡化。

(4)AChR-Ab滴度檢測(cè)免疫后7周經(jīng)頸動(dòng)脈采血分離血清，采用ELISA測(cè)定AChR-Ab含量。按公式：P/N=待測(cè)血清D（λ）490nm/正常組D(h)490nm計(jì)算。以P/N值≥2.l為陽性，≤1.4為陰性，介于兩者之間為可疑陽性

注意事項(xiàng)

(1)動(dòng)物選擇大鼠、小訊、豚鼠、家兔及猴均可誘導(dǎo)產(chǎn)生EAMG,但是不同種屬動(dòng)物易感性不同。目前最常用到的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為大鼠和小鼠，且大鼠EAMG模型和人類更為接近。大鼠近交品系對(duì)該模型的易感性依次為Wistar > munich > fischer > Lewis > Buffalo > Brown > Norway > ACI > Wistar Kyoto > Kopen-hagen > Wistar Furth,因此最常使用Wister大鼠作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。隨著轉(zhuǎn)基因小鼠的普遍使用，小鼠EAMG模型也逐漸受到重視，目前發(fā)現(xiàn)，C57BV6、SJL和AKP易感性較高，而SWR、BALB/c和C3H/He易感性較低。

(2)抗原的種類、選擇和制備傳統(tǒng)方法采用加利福尼亞電鰻電器官分離乙酰膽堿受體(AchR)免疫大鼠建立EAMG模型。隨著基因克隆技術(shù)的發(fā)展和人類對(duì)乙酰膽堿受體亞基及其氨基酸序列的深入研究，可以通過人工合成加利福尼亞電綬的AchR-o146-162序列片段作為免疫原，其氨基酸序列為：Ala-Ile-Phe-Lys-Ser-Tyr-Cys-Glu-Ile-Ile-Val-Thr-His-Phe-Pro-Phe-Asp。此外，Angela等用人類AChR-a的138-167、157-188、185-199、309-345和338-368片段作為免疫原對(duì)兔進(jìn)行動(dòng)物模型的制備，結(jié)果證明AChR-0138-167片段的成功率最高。