實(shí)驗(yàn)性自身免疫性神經(jīng)炎(EAN)模型

原理

實(shí)驗(yàn)性自身免疫性神經(jīng)炎(experimental all ergicalneuntis,EAN)于1955年由Waksman和Adams首次描述，其臨床經(jīng)過、神經(jīng)電生理檢查及病理學(xué)改變與吉蘭－巴雷綜合征最常見的臨床亞型－急性炎癥性脫髓鞘性多發(fā)神經(jīng)炎(acute inflammation demyelinative polyradieuloneuropathy, AIDP)極為相似，是公認(rèn)的研究吉蘭－巴雷綜合征的經(jīng)典動(dòng)物模型。

材料與儀器

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物6-8周齡 Lewis大鼠 體重150-170g

步驟

(1) 周圍神經(jīng)髓鞘的制備自牛脊神經(jīng)根提取周圍神經(jīng)髓磷脂(bovine peripheral mylin,BPM):

①取牛硬脊膜內(nèi)神經(jīng)根，-70℃凍存；②室溫融溶，剪碎，與0.3M蔗糖溶液混合，使用組織高速離散器制成5%(w/v)組織勻漿；③離心管中加入0.5M蔗糖溶液，再加入0.3M蔗糖組織勻漿（比例1:1),96000g,離心60min; ④收獲界面（乳白色中間層），加入蒸餾水懸浮，96000g,離心20min; ⑤取沉淀，對(duì)蒸餾水4L透析24h; ①～⑤步驟均在4℃操作。⑥-70℃凍干，-20℃保存?zhèn)溆谩?/span>

(2)模型制備方法包括：①第一次免疫(Od)異氟醚吸入麻醉下，背部四個(gè)不同位置進(jìn)行皮下注射，劑最為50μL的完全乳化液(200μg PO106-125+25μL鹽水和0.5mg結(jié)核分枝桿菌＋25μL弗氏不完全佐劑）；②第二次免疫(7d) 異氟醚吸入麻醉下，背部4個(gè)不同位置進(jìn)行皮下注射，劑釐為50μL的完全乳化液(200μg P0106-125+25μL鹽水和0.5mg結(jié)核分枝桿菌+25μL弗氏不完全佐劑）。

結(jié)果判定：成功模型主要表現(xiàn)為動(dòng)物體重不增，運(yùn)動(dòng)遲緩，先后出現(xiàn)兩后肢無力、癱瘓，嚴(yán)重者累及前肢，甚至呼吸困難、死亡。

(1)臨床評(píng)分分為：①0正常；②0.5全尾肌張力下降；③1.0尾部肌肉癱，松軟拖地；④1.5輕微后肢無力，肌張力下降；⑤2.0明顯后肢無力或輕度后肢癱；⑥2.5中度后肢癱；⑦3.0嚴(yán)重后肢癱；⑧4嚴(yán)重四肢癱。

(2)取材Lewis大鼠10%水合氯醛腹腔麻醉后，左側(cè)臀部剪毛、消毒，分離出坐骨神經(jīng)，剪取靠近脊柱側(cè)坐骨神經(jīng)長約1cm,4%甲醛固定，縱向包埋，常規(guī)石蠟切片。

(3)染色與觀察蘇木精－伊紅染色觀察Lewis大鼠坐骨神經(jīng)組織切片淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等炎性細(xì)胞的浸潤情況；固綠髓鞘染色法觀察Lewis大鼠坐骨神經(jīng)組織切片髓鞘脫失程度

注意事項(xiàng)

(1)動(dòng)物選擇Lewis大鼠、SJL小鼠、豚鼠、兔、猴、羊均可作為敏感動(dòng)物來誘導(dǎo)EAN,其中豚鼠和SJL小鼠的使用最為廣泛。

(2)抗原的種類、選擇和制備近年來在研究誘導(dǎo)EAN的免疫原方面有了很大進(jìn)展，從最初用周圍神經(jīng)組織勻漿誘導(dǎo)EAN逐步發(fā)展用周圍神經(jīng)系統(tǒng)的髓鞘P2蛋白、P2蛋白特異性T細(xì)胞株、P2中提取的肽段及人工合成肽段作為EAN的免疫原。MBP包括PO、Pl、P2,PO不具有免疫原性，Pl存在于中樞及周圍神經(jīng)中，用Pl蛋白加上完全佐劑免疫動(dòng)物可誘發(fā)EAE和EAN,P2只存在于周圍神經(jīng)中，用P2加上完全佐劑免疫動(dòng)物只會(huì)產(chǎn)生EAN,不產(chǎn)生EAE。最主要的模型是采用敏感鼠種Lewis大鼠。可用純化的周圍神經(jīng)髓磷脂，牛的P2蛋白，重組人的P2蛋白或P2蛋白肽53-78主動(dòng)誘導(dǎo)。SJL小鼠可有中度臨床癥狀和組織學(xué)損害，Balb/c小鼠對(duì)該模型相對(duì)抵抗。