影響酶切的幾個主要因素
影響酶切的幾個主要因素：
1. 質粒DNA的質量
1）質粒DNA的質量是決定酶切效率的最最要的因素。通常在克隆時，如果反復優化酶切條件后，都不能實現完全酶切，最可能的原因就是質粒DNA的質量有問題。
2）DNA的質量監測通常有兩個方法：
首先OD260/OD280比值應該在1.8左右（1.7-1.9），否則意味著DNA樣品中存在大量的蛋白質或RNA污染。
其次，瓊脂糖電泳分析時應主要以超螺旋條帶為主。
最多不超過三條帶（分別為超螺旋DNA，線性化DNA和環狀DNA）。否則意味質粒DNA的質量不高，應該重新制備。
2.限制性內切酶的活性
1）限制性內切酶一般需要低溫保存，而且反復的升降溫過程對酶活性的損害很明顯。因而為了確保在有效期內的限制性內切酶不會失活，限制性內切酶的日常保存和使用應當很小心。
2）建議購買具有保溫功能的凍存盒保存限制性內切酶（-20度），而且取用限制性內切酶時，也應該使用具有保溫功能的凍存盒，盡量防止酶的溫度反復出現大的波動。
3.限制性內切酶的用量
1）限制性內切酶的單位定義通常為：在合適的溫度下，完全消化1ugDNA底物所需的酶量定義為一個單位。
2）在這個單位定義中，有幾個不確定因素：
首先是底物，不同的酶單位定義是選擇的底物可能不同（常用的幾個底物DNA包括：Lambda DNA ,AD2 DNA 和一些質粒DNA）；
第二個不確定因素是限制性內切酶在底物DNA上的酶切位點的個數。
由于單位定義中要求完全消化，因而底物上某個酶的酶切位點的個數的多少，就直接影響了該酶的單位定義。
3）因而，在進行酶切時，用1ul酶（一般10IU/ul）消化1ugDNA的通常做法是很不科學的，這也導致在實際工作中，大家要進行多次預實驗才能確定最合適酶切條件。
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