Feulgen反應(yīng)顯示細(xì)胞中DNA
簡(jiǎn)介
Feulgen反應(yīng)由Feulgen在1924年發(fā)明，是一種傳統(tǒng)的、也是最為經(jīng)典的通過(guò)化學(xué)染色來(lái)特異性顯示細(xì)胞中DNA的方法。
原理
Feulgen反應(yīng)顯示細(xì)胞中DNA的基本原理是首先采用稀酸作用于DNA，使其脫去嘌呤堿，暴露出游離醛基，該醛基與Schiff試劑反應(yīng)生成紫紅色產(chǎn)物，細(xì)胞中存在有DNA的部位即呈現(xiàn)紫紅色陽(yáng)性反應(yīng)。如圖3-1中所示，堿性品紅是紅色物質(zhì)，能與產(chǎn)生SO2的試劑作用形成無(wú)色產(chǎn)物，即Schiff試劑，它可以與DNA水解釋放出的醛基結(jié)合而氧化為紫紅色化合物。
用途
Feulgen 反應(yīng)顯示細(xì)胞中 DNA 既可檢測(cè)細(xì)胞或組織中 DNA 的存在部位及分布，也可利用其顯色強(qiáng)度與 DNA 含量成正比的特性，用于對(duì)細(xì)胞或組織中的 DNA 含量進(jìn)行測(cè)定。由于反應(yīng)對(duì)含有 DNA 的核結(jié)構(gòu)顯示細(xì)致、清晰，染色穩(wěn)定，有利于鑒別不同核結(jié)構(gòu)和分化程度的細(xì)胞，如白血病細(xì)胞等。
材料與儀器
器材：
尖頭鑷子、染色缸、蓋片、載玻片、吸管、吸水濾紙、普通光學(xué)顯微鏡、恒溫水浴箱、CO2培養(yǎng)箱、HeLa人宮頸癌上皮細(xì)胞。
試劑：
①Hanks液
（1）原液甲NaCl 160 g ，KC18 g ，MgSO4?7H2O2 g ；MgCl2?6H2O2 g ，溶于800 mL 蒸餾水中。CaCl2（無(wú)水）2.8 g ，溶于100 mL 蒸餾水中。將兩種液體混合后，加水至1000 mL ，用濾紙濾過(guò)，再加2 mL 氯仿防腐，置4 ℃ 冰箱備用。
（2）原液乙 Na2HPO4?12H2O3.04 g ，KH2PO41.2 g ，葡萄糖20.0 g ，溶于800 mL 蒸餾水中，用濾紙過(guò)濾，然后加0.5％酚紅80 mL ，再加水至1000 mL ，最后加入2 mL 氯仿防腐，置4 ℃ 冰箱備用。
（3）使用液甲乙兩液各1 份 ，雙蒸水18 份 ，混勻分裝，經(jīng)101 bf ／in （68.9 kPa ）15 min 高壓滅菌后置4 ℃ 冰箱中保存。臨用前用無(wú)菌的5.6％NaHCO3 調(diào)至所需 pH 值。）
②1 mol ／L 鹽酸
③Schiff 試劑
（堿性品紅0.5 g 加入100 mL 煮沸的蒸餾水中，持續(xù)煮沸5 min ，并隨時(shí)攪拌，使之充分溶解。然后將其冷卻到50 ℃ ，過(guò)濾到棕色瓶中，加1 mol ／L HC110 mL ，冷卻至25 ℃ 時(shí)加入1 g 無(wú)水亞硫酸氫鈉（NaHSO3），需充分振蕩后，避光過(guò)夜。次日取出（呈淡黃色），加0.25 g 活性炭劇烈振蕩1 min ，過(guò)濾后即得 Schiff 試劑，此時(shí)溶液應(yīng)完全無(wú)色。避光、低溫、密封保存。用前應(yīng)事先取出使其恢復(fù)至室溫。）
④ Carnoy 固定液（甲醇:冰醋酸＝3:1）
⑤0.5％亮綠
⑥蒸餾水
⑦70％乙醇
⑧80％乙醇
⑨95％乙醇
⑩無(wú)水乙醇
?二甲苯
?中性樹(shù)膠
步驟
Feulgen 反應(yīng)顯示細(xì)胞中 DNA 的基本過(guò)程可分為如下幾步：
A.將培養(yǎng)的 HeLa 細(xì)胞接種于蓋片，24～48 h 后生長(zhǎng)為單層。
B.取細(xì)胞蓋片1 張 ，用 Hanks 液（pH 7.2～7.4）漂洗3 次 ，吸水濾紙吸干液體。
C.放入 Carnoy 固定液中固定30 min 。
D.蒸餾水洗3 次 。
E.將蓋片置于1 mol ／L 鹽酸中，60 ℃ 水浴水解10 min 。
F.蒸餾水洗1 次 。
G.將蓋片移入 Schiff 試劑中，暗處反應(yīng)30 min 。
H.流水沖洗5 min 。
I.蒸餾水洗3 次 。
J.0.5％亮綠復(fù)染1～3 min 。
K.70％乙醇→80％乙醇→95％乙醇→無(wú)水乙醇梯度脫水。
L.蓋片浸入二甲苯中透明5 min 。
M.滴1 滴 中性樹(shù)膠于載玻片上，將蓋片細(xì)胞面朝下封片。
N.鏡下觀察。
注意事項(xiàng)
1.本實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵步驟是有效地控制DNA水解的程度，包括稀酸的濃度，水解的時(shí)間、溫度等。水解不足，會(huì)使游離醛基的暴露不完全，反應(yīng)變?nèi)酰凰膺^(guò)度，會(huì)導(dǎo)致 DNA 異常降解，也同樣使反應(yīng)變?nèi)酰旧疃认陆担瑖?yán)重時(shí)出現(xiàn)陰性反應(yīng)。一般的水解時(shí)間應(yīng)控制在10～15 min ，同時(shí)應(yīng)考慮不同標(biāo)本材料的影響。
2. Schiff 試劑的質(zhì)量也是影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重要因素，試劑暴露于空氣中易被氧化而變成紅色，使試劑失效。操作及保存中不宜過(guò)多暴露于空氣，并應(yīng)注意避光。
3.本實(shí)驗(yàn)采用蓋片培養(yǎng)細(xì)胞，因此在整個(gè)操作過(guò)程中，應(yīng)注明蓋片的正反面，防止破壞細(xì)胞面，尤其在進(jìn)行流水沖洗步驟時(shí)，應(yīng)避免水流直接接觸細(xì)胞面。
