間接免疫熒光技術顯示胞質微管

簡介

微管是真核細胞普遍存在的結構。它是由 a、β 微管蛋白異二聚體和少量微管結合蛋白聚合而成的中空管狀纖維。在不同類型的細胞中，微管具有相同的基本形態。微管中的單管在胞質內呈網狀或束狀分布；二聯管構成纖毛、鞭毛的周圍部分；三聯管構成中心粒以及纖毛、鞭毛基體。觀察微管可用電鏡和免疫細胞化學技術，其中較常用的有間接免疫熒光法。

原理

間接免疫熒光技術顯示胞質微管實驗的基本原理是先用抗微管蛋白（tubulin）的免疫血清（一抗）與體外培養細胞一起溫育，該抗體與細胞內微管特異結合，然后用異硫氰酸熒光素（FITC）標記的羊抗兔（IgG）血清（二抗）與一抗溫育而結合，從而使微管間接地標上熒光素。在熒光顯微鏡下，即可看到胞質內伸展的微管網絡。間接免疫熒光法除靈敏性高外，它只需要制備一種種屬間接熒光抗體，可以適用于多種第一抗體的標記顯示，廣泛應用于生物大分子的結構定位和形態顯示。

材料與儀器

器材：

細胞培養設備、倒置顯微鏡、熒光顯微鏡、冰箱、微量加樣器（100 μl）、振蕩器、鋁盒、常規實驗器械、體外培養的成纖維細胞。

試劑：

① 0.01 mol/L（pH7.2）磷酸鹽緩沖生理鹽水（PBS）

② PEMP 緩沖液

③ 固定液（3.7％ 甲醛-PEMD 溶液）

④ 0.5％ Triton X-100/PEMP 溶液

⑤ 1％ Triton X-100/PBS 溶液

⑥ 兔抗微管蛋白抗體

⑦ 異硫氰酸熒光素 (FITC)-羊抗兔抗體

⑧ 甘油-PBS緩沖液 9:1，pH8.5~9.0)

步驟

間接免疫熒光技術顯示胞質微管的基本過程可分為如下幾步：

A 把成纖維細胞培養在玻片上，長到十十～十十十時取出。

B 將長有單層細胞的玻片投入 PEMP 緩沖液漂洗。

C 放在預溫到 37 ℃ 的 0.5％ Triton X-100/PEMP 溶液中，處理 1.5～2 min。

D PEMP 洗 2 次。

E 3.7％ 甲醛-PEMD 溶液固定 30 min，室溫下。

F pH7.2 的 PBS 洗 2 次，每次 5 min。濾紙吸干余留液體。

G 結合一抗。把長有細胞的一面朝上，平置于盛有 PBS 濕紗布的鋁盒內，小心滴加經適當稀釋的兔抗微管蛋白抗體 40 μl 于細胞層上，密閉，37 ℃ 溫箱中溫育 40～60 min。

H 取出玻片，吸去抗體液，放入 35 mm 小染缸內，按下列順序洗滌：PBS→1％ Triton X-100/PBS→PBS，每次 5～10 min。攪拌或放在振蕩器上輕輕振蕩洗滌，以洗去未結合的抗體。濾紙吸去余留液體，略干燥。

I 結合二抗。在細胞面上滴加 40 μl 經稀釋的 FITC-羊抗兔抗體，步驟同（7）。

J 取出玻片，吸去剩余抗體，浸泡漂洗，以洗去未結合的抗體。步驟同（8）。最后過去離子水 2 次

K 略干燥后，滴加甘油-PBS（91）于玻片上，用載玻片封蓋。

注意事項

1 每步洗滌要充分，并吸去水分（但不要干透），以免稀釋下一步的抗體或試劑，這樣才能得到清晰的熒光圖像。

2 合適的抗體稀釋度。抗體的稀釋主要是指“一抗”，因為“一抗”中特異性抗體合適的濃度是關鍵。“一抗”、“二抗”在使用前應試驗最佳稀釋度，以特異性染色反應熒光最強，而非特異性染色陰性為佳。

3 孵育時間為 30～60 min，溫度常用 37 ℃，該溫度可增強抗原-抗體反應，但應在濕盒中進行，防止標本干燥導致失敗。

4 標本染色后應立即觀察，時間過長熒光會逐漸減弱。標本若放聚乙烯袋中 4 ℃ 保存，可延緩熒光減弱時間，防止固封劑蒸發。