人胚胎干細胞傳代培養(yǎng)

簡介

胚胎干細胞是具有一種具有自我更新和全能分化能力的細胞，能發(fā)育分化出成體所有的組織和器官，是體外研究發(fā)育調控機制最為理想的模型，也是用于人類疾病的干細胞治療和器官組織移植最理想的種子細胞。建立新的人類胚胎干細胞系仍然有很大的倫理學爭議，目前對人胚胎干細胞的研究主要就是基于已經建立的人胚胎干細胞系的研究。

原理

人胚胎干細胞傳代培養(yǎng)的原理是人胚胎干細胞快速生長和擴增，而細胞培養(yǎng)箱恰恰能提供培養(yǎng)所需的環(huán)境。

用途

胚胎干細胞常用于發(fā)育分化出成體所有的組織和器官，是體外研究發(fā)育調控機制最為理想的模型，也是用于人類疾病的干細胞治療和器官組織移植最理想的種子細胞。

材料與儀器

器材：37 ℃ 水浴鍋、一次性無菌培養(yǎng)皿、一次性無菌移液管

T75 培養(yǎng)瓶、15 mL 離心管、注射器和針頭、涂有明膠的 6 孔板

試劑、材料：提前制備好的飼養(yǎng)層細胞、95％ 乙醇

步驟

人胚胎干細胞傳代培養(yǎng)的基本過程可分為如下幾步：

（一）試劑配制

1. 膠原酶溶液的配制使用濃度 1 mg/mL。膠原酶，30 mg；DF12 培養(yǎng)基，30 mL。使膠原酶充分溶解于 DF12 基礎培養(yǎng)基。用 0.22 μm 濾器過濾除菌。

2. 胚胎干細胞培養(yǎng)基的配制 DF12 培養(yǎng)基，200 mL；血清替代物 50 mL ；200 mmol/L -谷酰胺 ＋ 2-巰基乙醇溶液，1.25 mL；非必需氨基酸 100x 溶液，2.5 mL ；b-FGF 溶液，5 mL 。

所有組分都加入 250 ml 培養(yǎng)瓶中，用 0.22 μm 濾器過濾除菌。培養(yǎng)基最好在 2 周內使用。

3. 200 mmol/L -谷酰胺 ＋ 2-巰基乙醇溶液的配制 200 mmol/L -谷酰胺，5 mL；2-巰基乙醇，7 μl，混勻。

4. b-FGF的配制b-FGF，10 μg ；0.1％BSA無菌，5 mL 溶解后按0.5 mL 每份分裝冷凍保存。

（二）確定傳代時機

通常以下情況時，胚胎干細胞需要傳代

1. 小鼠胚胎成纖維細胞（mouse embryonic fibroblasts，MEF）飼養(yǎng)層超過 2 周。

2. 胚胎干細胞的克隆密度太高或克隆大小太大。

3. 胚胎干細胞克隆出現(xiàn)分化現(xiàn)象。

（三）膠原酶處理

1. 需要傳代時，將胚胎干細胞培養(yǎng)板從培養(yǎng)箱取出，吸去培養(yǎng)上清。

2. 6 孔板培養(yǎng)時，每個孔加 1 mL 膠原酶溶液。

3. 處理至少 5 min。

4. 倒置顯微鏡下觀察，直至細胞克隆從培養(yǎng)板表面脫離。注意：可以看到克隆周邊會出現(xiàn)皺褶。根據消化情況，膠原酶處理時間可再延長 6~10 min。

5. 刮細胞

① 玻璃移液管，將細胞從培養(yǎng)板表面刮下來。

② 同時輕輕吹打膠原酶溶液，使細胞從培養(yǎng)板上面完全脫離。

③ 所有細胞團都留在培養(yǎng)板中，直到整個 6 孔板都按步驟（1）、（2）處理完。

注意：這些步驟可以直視下完成，也可以在解剖纖維鏡下完成。

（五）收集并打散克隆

1. 將整塊 6 孔 板的細胞都轉移到一個 15 mL 離心管中。

2. 每個孔加 1 mL 胚胎干細胞培養(yǎng)基沖洗，并將沖洗液也轉移到細胞懸液中。

3. 在 15 mL 離心管中，輕輕吹打細胞懸液數(shù)分鐘，進一步打散細胞克隆。注意：吹打時避免產生氣泡。

（六）離心傳代

1. 將打散的細胞克隆，200 g 離心 5 min 。

2. 去除上清液。

3. 輕輕拍散細胞團，加 2~3 mL 胚胎干細胞培養(yǎng)基重懸細胞，輕輕混勻。

4. 200 g 離心5 min 。

5. 胚胎干細胞離心同時，將提前準備好的飼養(yǎng)層培養(yǎng)板取出，吸棄 MEF 培養(yǎng)基。

6. 用 6 孔板培養(yǎng)的飼養(yǎng)層，每個孔加 1 mL PBS，輕輕晃動，洗去培養(yǎng)基中所含的血清。

注意：PBS 處理成纖維細胞的時間不要超過 6~10 min。

7. 胚胎干細胞離心結束后，棄去上清液，輕輕拍散細胞團。

8. 加入 2~3 mL 胚胎干細胞培養(yǎng)基，重懸細胞。

9. 再加入足夠的胚胎干細胞培養(yǎng)基，使 6 孔 板的每個孔細胞懸液體積為 2.5 mL。

10. 去除飼養(yǎng)層培養(yǎng)板中的 PBS，每個孔加入 2.5 mL 細胞懸液，用移液管輕輕混勻。

11. 在水平臺面上，短促地上下左右地晃動培養(yǎng)板，使加入的胚胎干細胞均勻分布到飼養(yǎng)層上。

12. 將培養(yǎng)的胚胎干細胞放入培養(yǎng)箱，使克隆重新貼壁。注意：在重新貼壁的這段時間內，要盡量少開關培養(yǎng)箱，維持培養(yǎng)環(huán)境的穩(wěn)定，以利于胚胎干細胞重新貼壁。

13. 每天更換新鮮培養(yǎng)基。注意觀察克隆生長狀態(tài)，在需要時按上述步驟再次傳代。

（七）凍存

1. 按上述步驟收集胚胎干細胞細胞懸液，200 g 離心 5 min 。

2. 配好的凍存液（90％ 胎牛血清，10％ DMSO）置于冰上備用。

3. 棄去上清液，將細胞團排松散后用凍存液重懸，逐滴加入凍存液，混勻。一般一個 6 孔培養(yǎng)板凍 6 支，重懸時每個培養(yǎng)板的細胞加 6 mL 凍存液。

4. 迅速將 1 mL 細胞懸液裝入 1.5 mL 凍存管。蓋緊后放入異丙醇凍存盒中。

5. 將凍存盒降至室溫后，轉入 -80 ℃ 冰箱，保存過夜。

6. 次日將凍存的細胞轉入液氮罐保存。

注意：人胚胎干細胞凍存前不能將細胞消化成單細胞，消化后的細胞團塊稍大為好。

（八）復蘇

1. 將凍存的胚胎干細胞從液氮中取出，浸入 37 ℃ 水浴，輕輕轉動，注意凍存管蓋不要沒入水中。

2. 當只剩一個小冰晶時，將凍存管從水浴中取出。

3. 將凍存管浸入 95％ 乙醇浴消毒，在無菌超凈臺中晾干。

4. 將細胞從凍存管中轉入 15 mL 離心管中，逐滴加入 4 mL 胚胎干細胞培養(yǎng)基，輕輕混勻。

5. 200 g 離心 5 min，去除凍存液。

6. 去除上清液，將細胞團輕輕拍散，加 2.5 mL 胚胎干細胞培養(yǎng)基重懸細胞。

7. 將細胞懸液轉移到鋪有照射后的飼養(yǎng)層細胞的 6 孔板中。每孔加 2.5 mL 細胞懸液。飼養(yǎng)層細胞提前用 1 mL PBS 洗一遍，去除血清。

8. 放入培養(yǎng)箱，第二天將細胞上面漂浮的死細胞吸去并換液，按常規(guī)方法繼續(xù)培養(yǎng)。

9. 每天觀察細胞密度，按需傳代。

注意事項

1. 所有試劑都應記錄保質期和批號，小包裝分裝保存，避免反復凍存。培養(yǎng)基配制后最好在 2 周內用完。

2. 胚胎干細胞克隆的消化液可有多種選擇，除了上文介紹的膠原酶消化，也可用 0.05％ 的胰蛋白酶消化，消化時間比膠原酶消化所需時間要短，一般 1~2 min，待克隆周邊有皺褶時，要加用 MEF 培養(yǎng)基中止胰蛋白酶作用，其他步驟基本一致。

3. 用消化傳代的時候務必不能將人胚胎干細胞消化成單個細胞，否則克隆形成率很低。

4. 傳代時細胞密度很重要，人胚胎干細胞一般的傳代比例是 1:5~1:10。接種的細胞太少不易生長，最好 4~6 d 傳代一次。

5. 人胚胎干細胞對營養(yǎng)要求很高，因此必須每天換液，細胞一般培養(yǎng)在 6 孔皿中。

6. 一般使用第 2~4 代 的小鼠成纖維細胞（MEF）作為飼養(yǎng)層細胞。細胞接種到培養(yǎng)皿后一般在 3 d 內使用，放置時間過長的飼養(yǎng)層細胞不利于人胚胎干細胞生長。

7. 人胚胎干細胞的培養(yǎng)環(huán)境是 37 ℃ ，飽和濕度，5％ CO2。培養(yǎng)箱應當每月清洗和衡一次，最好不要在同一培養(yǎng)箱內再培養(yǎng)其他種類的細胞，以免交叉污染。