微絲染色及形態觀察實驗

簡介

真核細胞胞質中縱橫交錯的纖維網稱為細胞骨架。根據纖維直徑、組成成分和組裝結構的不同分為微管、微絲和中間纖維。目前觀察細胞骨架的手段主要有電鏡、間接免疫熒光技術、酶標和組織化學等。微絲是肌動蛋白構成的纖維。單根微絲直徑約 7 nm，在光學顯微鏡下看不到。在不同種類的細胞中，它們與某些結合蛋白一起形成不同的亞細胞結構，如肌肉細絲、腸上皮微絨毛軸心和應力纖維等。本實驗用考馬斯亮藍 R250（Coomassie brilliant blue R250）顯示微絲組成的應力纖維。應力纖維在體外培養的貼壁細胞中尤為發達，與細胞對培養基質的附著和維持細胞扁平鋪展的形狀有關。

原理

微絲染色及形態觀察實驗的基本原理是考馬斯亮藍 R250 可以染各種蛋白，并非特異染微絲。但在該實驗條件下，微管結構不穩定，有些類型的纖維太細，光學顯微鏡下無法分辨。因此，我們看到的主要是由微絲組成的應力纖維，直徑約 40 nm。

材料與儀器

器材：細胞培養設備、倒置顯微鏡、恒溫箱、顯微鏡、25 ml 稱量瓶、常規實驗器械、體外培養的貼壁生長細胞、洋蔥鱗莖。

試劑：

① 6 mmol/L PBS（pH6.5）

（A 液：NaH2PO4·2H2O，936 mg/1000 ml。B 液：Na2HPO4·12 H2O，2148 mg/1000 ml。工作液：A 液 68.5 ml＋B 液 31.5 ml（用 NaHCO3 調 pH 至 6.5）

② M 緩沖液（pH7.2）

（咪唑，3.40 g；KCl，3.71 g；MgCl2·6H2O，101.65 mg；EGTA（乙二醇雙醚四乙酸），380.35 mg；EDTA（乙二胺四乙酸），29.22 mg；巰基乙醇（mer-captoethanol），0.07 ml；甘油，292 ml；加蒸餾水至 1000 ml（用 1 mol/LHCl 調 pH 至 7.2））

③ 1％ Triton X-100

④ 0.2％ 考馬斯亮藍 R250 染液

⑤ 3％ 戊二醛

步驟

微絲染色及形態觀察實驗的基本過程可分為如下幾步：

（一）動物細胞微絲的顯示與觀察

A 取材 細胞培養在蓋玻片上（為區別細胞的正反面，剪掉一角），生長密度達十十～十十十時取出，細胞面朝上放在稱量瓶內，用 6 mmol/LPBS 洗 3 次，每次 1 min。

B 抽提 棄去 PBS 洗液，入 2 ml 1％ Triton X-100，蓋上稱量瓶蓋子，置于墊有濕紗布的鋁盒中，放入 37 ℃ 恒溫箱處理 25～30 min。

C 沖洗 棄去 1％ Triton X-100，加入 2 ml M 緩沖液輕輕洗細胞 3 次，每次 2 min。M 緩沖液有穩定細胞骨架的作用。

D 固定 略晾干后，加入 2 ml 3％ 戊二醛，固定細胞 15 min。

E 沖洗 棄去固定液，用 6 mmol/L PBS 輕輕洗 3 次，每次 2 min。

F 染色 棄去洗液，把小蓋片立于吸水濾紙上，吸去標本邊緣水分。加入 2 ml 0.2％ 考馬斯亮藍 R250 染色 20 min。

G 沖洗 用蒸餾水輕輕洗去標本上的染液，濾紙吸干標本邊緣水分，空氣干燥，直接觀察或樹脂封片。

（二）植物細胞微絲的顯示與觀察

A 取材 用鑷子撕取洋蔥鱗莖內表皮，大小約 1 c㎡，放入盛有 6 mmol/L PBS 的稱量瓶中，使其下沉，處理 5～10 min。

B 抽提 棄去 PBS，加入 2 ml 1％ Triton X-100，蓋上稱量瓶蓋子，置于墊有濕紗布的鋁盒中，放入 37℃ 恒溫箱中處理 30 min。

C 沖洗 棄去 1％ Triton X-100，加入 2 ml M 緩沖液輕輕洗洋蔥內表皮，每次 3～5 min，共 3 次。

D 固定 加入 2 ml 3％ 戊二醛固定 20 min。

E 沖洗 棄去固定液，加入 2 ml 6 mmol/L PBS 輕輕洗洋蔥內表皮，每次 3～5 min，共 3 次，吸水濾紙吸去殘液。

F 染色 加入 2 ml 0.2％ 考馬斯亮藍 R250 染色 20 min。

G 制片 棄去染液，用蒸餾水輕輕洗 3 次。把標本平鋪在載玻片上，加蓋玻片。鏡檢。

注意事項

1 沿稱量瓶內壁緩慢加入各種試劑，避免直接滴落在蓋片上；洗細胞動作要輕，避免細胞脫落。

2 抽提、固定及染色須在加蓋的稱量瓶中進行，并且蓋玻片的細胞面始終朝上。

3 用 1％ Triton X-100 抽提雜蛋白和脂類要做預實驗，抽提時間長將破壞細胞結構，抽提時間短背景干擾大。

4 應力纖維是一種動態結構，細胞充分貼壁鋪展時纖維挺拔、豐富；反之，細胞收縮變圓，應力纖維彎曲，甚至部分解聚消失而顯稀少。