植物線粒體膜蛋白提取試劑盒的應(yīng)用及操作步驟
一、背景
植物線粒體膜蛋白提取試劑盒可用于從植物葉片組織中分離出完整而純化的線粒體。適合于田間采摘或者實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的植物葉片中線粒體的制備。其制備物，可以被用于細(xì)胞凋亡、信號(hào)傳遞、代謝和蛋白組學(xué)等的研究。但不適用于進(jìn)一步DNA提取。
二、操作步驟
1、樣本采集前處理：無(wú)論田間自然生長(zhǎng)還是實(shí)驗(yàn)室組織培養(yǎng)，采摘前須避光生長(zhǎng)24-48小時(shí)，以減少葉片組織中糖類(lèi)及葉綠體含量。取適量Lysis Buffer，加入0.5%β-巰基乙醇，10ml Lysis Buffer加入50ulβ-巰基乙醇，混勻，形成Lysis Buffer/β-巰基乙醇溶液，此溶液可2-8度保存一個(gè)月。
2、葉片用蒸餾水清洗2-3次，濾紙吸干，有條件請(qǐng)用液氮研磨葉片1-2克，研磨完后，取800mg左右研磨的葉片粉，加入1.5ml預(yù)冷的Lysis Buffer/β-巰基乙醇溶液，混勻。如果無(wú)條件（無(wú)液氮），請(qǐng)預(yù)冷研缽，取洗過(guò)的葉片1000 mg，用剪刀剪為碎塊放入玻璃勻漿器或者研缽中。加入1.5ml預(yù)冷的Lysis Buffer/β-巰基乙醇溶液，冰上研磨至看不見(jiàn)明顯組織塊；
3、將研磨物放置合適的離心管，4℃，1000×g離心5 min；
4、將上清轉(zhuǎn)移到一新的離心管中，在沉淀中加入0.5ml Lysis Buffer/β-巰基乙醇溶液，混勻，再次4℃，1000×g離心5 min，取上清；合并兩次上清，將上清4℃1000×g再次離心5 min。
5、取上清，加入一新的離心管中，4℃，16,000×g離心10 min。離心后的上清含胞漿成分，可從中提取胞漿蛋白。將上清轉(zhuǎn)移到新離心管，線粒體沉淀在管底。
6、在線粒體沉淀中加入0.5 mL Wash Buffer重懸線粒體沉淀，4℃，1000×g離心5 min；
7、取上清，加入一新的離心管中，4℃，16,000×g離心10 min。棄上清，高純度的線粒體沉淀在管底；
8、用50-100μL Store Buffer或合適的反應(yīng)緩沖液重懸線粒體沉淀，立即使用或-70℃保存。
三、應(yīng)用
用于紅蓮型細(xì)胞質(zhì)雄性不育水稻線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)分析研究:
采用差速離心配合Percoll梯度離心技術(shù),從不育系粵泰A（Yuetai A,YtA）及其保持系粵泰B（Yuetai B,YtB）黃化苗中純化得到線粒體。利用雙甲基化標(biāo)簽質(zhì)譜定量技術(shù),比較研究了二者線粒體總蛋白質(zhì)組的差異。并且配合藍(lán)綠膠電泳技術(shù)（Blue native polyacrylamide gel electrophoresis,BN-PAGE）及2D BN/Tricine-SDS PAGE.比較研究了線粒體蛋白質(zhì)復(fù)合體亞基組成和含量的差異。
線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)分析共鑒定得到216個(gè)水稻線粒體蛋白,其中208個(gè)蛋白為線粒體總蛋白,91個(gè)蛋白為參與復(fù)合體組裝的蛋白,83個(gè)蛋白同時(shí)包含上述二者定量信息。216個(gè)線粒體蛋白依功能可分為12類(lèi),覆蓋絕大部分線粒體功能。
肽段數(shù)目和BN組分關(guān)聯(lián)分析顯示參與同一復(fù)合體組裝的亞基在BN膠中呈現(xiàn)聚合效應(yīng),說(shuō)明BN膠內(nèi)蛋白定量信息能間接反映復(fù)合體定量信息。
深入分析不育系和可育系線粒體總蛋白與復(fù)合體的定量信息,發(fā)現(xiàn)不育系線粒體內(nèi)大部分蛋白的總含量上升,這些蛋白實(shí)際參與復(fù)合體組裝的含量卻低于可育系,其中負(fù)責(zé)氧化磷酸化的復(fù)合體Ⅰ和復(fù)合體V表現(xiàn)得尤為典型,說(shuō)明不育系中復(fù)合體組裝過(guò)程存在缺陷。
不育系線粒體中大量氧自由基（Reactive oxygen species,ROS）及脅迫響應(yīng)相關(guān)蛋白普遍上調(diào),從蛋白水平應(yīng)證了不育系受到嚴(yán)重的氧化脅迫,認(rèn)為氧化脅迫導(dǎo)致不育系中線粒體蛋白氧化受損,進(jìn)而影響復(fù)合體組裝。
線粒體總蛋白質(zhì)組學(xué)分析發(fā)現(xiàn),大部分線粒體蛋白變化在2倍以?xún)?nèi),然而有4個(gè)蛋白在不育系中上調(diào)2倍以上,其中2個(gè)為花穗性決定類(lèi)似蛋白（sex determination TASSELSEED2like protein,TS2）（Os07g46920.1,Os07g40250.1）,它們上調(diào)達(dá)到4到6倍。
