Caspase-3活性檢測法

原理

Caspase家族在介導細胞凋亡的過程中起著非常重要的作用，其中caspase-3為關鍵的執行分子，它在凋亡信號傳導的許多途徑中發揮功能。Caspase-3正常以酶原（32KD）的形式存在于胞漿中，在凋亡的早期階段，它被激活，活化的Caspase-3由兩個大亞基（17KD）和兩個小亞基（12KD）組成，裂解相應的胞漿胞核底物，最終導致細胞凋亡。但在細胞凋亡的晚期和死亡細胞，caspase-3的活性明顯下降。

材料與儀器

細胞
Ac-DEVD-AMC 磷酸緩沖液蒸餾水脫脂奶粉 Caspase-3多抗吐溫
硝酸纖維素膜 PVDF膜熒光分光光度計 UV 流式細胞計燒杯移液管引流棒

步驟

一、Western blot 分析Procaspase-3的活化，以及活化的Caspase-3及對底物多聚（ADP-核糖）聚合酶[poly（ADP-ribose）polymerase，PARP]等的裂解。

1. 方法

收集細胞→PBS洗滌→抽提細胞裂解液→蛋白定量→SDS-PAGE電泳→硝酸纖維素膜或PVDF膜轉移→5%脫脂奶粉封閉，室溫1.5~2 h或4°C過夜→Caspase-3多抗或單抗室溫反應1~2 h或4°C過夜→TBS-T（含0.05% Tween 20的TBS）洗3次，5~10 min/次→HRP-標記的羊抗鼠IgG或AP標記的羊抗鼠IgG室溫反應1~2 h→ TBS-T洗3次， 5~10 min/次?→ECL顯影或NBT/BCIP顯色。

2. 結果

二、熒光分光光度計分析

1. 原理
活化的Caspase-3能夠特異切割D1E2V3D4-X底物，水解D4-X肽鍵。根據這一特點，設計出熒光物質偶聯的短肽Ac-DEVD-AMC。在共價偶聯時，AMC不能被激發熒光，短肽被水解后釋放出AMC，自由的AMC才能被激發發射熒光。根據釋放的AMC熒光強度的大小，可以測定caspase-3的活性，從而反映Caspase-3被活化的程度。

2. 方法
收獲細胞正常或凋亡細胞→PBS洗滌→制備細胞裂解液→加Ac-DEVD-AMC（caspase-3四肽熒光底物）→37°C反應1 h→熒光分光光度計（Polarstar）分析熒光強度（激發光波長380 nm，發射光波長為430-460 nm）。

3. 結果