體外分化法
原理
胚胎干細胞在體內(nèi)外可以分化為各種類型的細胞。我們的體外分化方法有利于神經(jīng)前體細胞通過在最少量的培養(yǎng)基內(nèi)選擇（第3步），在有bFGF存在的情況下擴增（第4步）并最終分化在第5步。細胞全程培養(yǎng)在37℃，5％CO2，100％濕度條件下。一般體外誘導向神經(jīng)細胞方向分化，也可以采用低濃度的RA進行誘導。
材料與儀器
小鼠
明膠 PBS DMEM 馬血清 L-谷氨酰胺 HEPES β-巰基乙醇 PEST LIF
培養(yǎng)板 離心管 水浴鍋 離心機 6孔板 24孔板
步驟
一、ES培養(yǎng)基
在LIF存在的條件下維持細胞培養(yǎng)。
二、EB培養(yǎng)基
使用細菌培養(yǎng)皿去除LIF后胚狀體的形成需要4天。
1. 分散純化細胞（參見上面的細胞傳代部分）。
2. 純化2小時后將細胞轉(zhuǎn)入含有ES培養(yǎng)基的50 ml Falcon管中，計數(shù)細胞取適量體積放入15 ml管中離心3分鐘。
3. 用2mlEB培養(yǎng)基重懸細胞，吹打至少10次制成單細胞懸液
4. 一個15 cm的細菌培養(yǎng)皿接種4～5x106個細胞（1個完全融合的組織培養(yǎng)皿通常足以接種4個同樣規(guī)格的細菌培養(yǎng)皿）。
5. 2天后更換培養(yǎng)基，將胚狀體轉(zhuǎn)入錐形管中放置3～5分鐘使細胞沉降。棄去上清，將細胞重懸于新鮮培養(yǎng)基并接種在新的細菌培養(yǎng)皿中。
6. 用EB培養(yǎng)基培養(yǎng)的第4天將細胞轉(zhuǎn)入沒有包被的組織培養(yǎng)皿中（這即是細胞的移植步驟）。1個組織培養(yǎng)皿之中放置1個細菌培養(yǎng)皿，在進行第3步之前一天將胚狀體黏附在同樣規(guī)格的培養(yǎng)板上。
7. 形成胚狀體需要4天時間。在EB培養(yǎng)基中再培養(yǎng)1天使胚狀體粘附在組織培養(yǎng)皿的表面。這一天被認為是第2步和第3步的分界。
三、ITSFn培養(yǎng)基
在最少量培養(yǎng)基中選擇神經(jīng)前體細胞
1. 胚狀體接種在組織培養(yǎng)皿一天后將培養(yǎng)基換成ITSFn培養(yǎng)基。
2. 并非所有胚狀體在這一時期都已經(jīng)發(fā)生粘附，因此在移除培養(yǎng)基時要小心謹慎以使大部分胚狀體留在培養(yǎng)皿內(nèi)。
3. 保持細胞在ITSFn中培養(yǎng)大約10天，根據(jù)需要更換培養(yǎng)基--大約每隔一天。
4. 觀察細胞形態(tài)，神經(jīng)樣細胞大約出現(xiàn)在第4到第7天。當神經(jīng)樣細胞能夠被鑒別時，轉(zhuǎn)入到第4步。步驟的轉(zhuǎn)換應該在神經(jīng)前體細胞出現(xiàn)第一個清晰的標志幾天以后，通常是在第3步的第6到第10天。
四、N3培養(yǎng)基＋bFGF
通過將神經(jīng)前體細胞培養(yǎng)在含有10ng/ml bFGF的培養(yǎng)基中進行擴增。
1. PBS洗滌，加入1-2 ml 胰酶。
2. 37℃孵育5分鐘。
3. 用4mlEB培養(yǎng)基終止胰酶活，將細胞轉(zhuǎn)入錐形管中放置3～5分鐘移出細胞團，將上清移入一新的離心管離心。
4. 將細胞重懸于含有bFGF的N3培養(yǎng)基。
5. 將細胞接種在包被多聚-L-鳥氨酸/纖維連接蛋白的蓋玻片上（最好將蓋玻片放于24孔培養(yǎng)板或6孔培養(yǎng)板，6孔培養(yǎng)板中每孔放置5個蓋玻片如果是塑料的放置4個，以使最大可能的獲得樣品數(shù)量）。24孔板接種3.5x105/孔或6孔板1.7x106 /孔。
6. 2天后更換培養(yǎng)基。
五、N3培養(yǎng)基
通過撤除bFGF使神經(jīng)前體細胞分化。
1. 細胞被接種在蓋玻片上4天后將培養(yǎng)基換成不含bFGF的N3培養(yǎng)基。
2. 根據(jù)需要換液（大約每隔一天）。
3. 分化10～15天后固定細胞。
4. 移除培養(yǎng)基。
5. PBS洗滌，加入4%福爾馬林，室溫放置30分鐘，PBS洗滌2次儲存于PBS。
6. 長期儲存使用含0.01%疊氮化納的PBS。
六、移植細胞的準備
細胞在胚狀體形成4天以后被移植（相應于體外分化過程中的第2步末細胞被轉(zhuǎn)種到組織培養(yǎng)板）。正如在前文體外分化中所描述的在移植之前4天開始形成胚狀體。通常再需要一天時間以便將胚狀體移植入一10 cm的培養(yǎng)皿。
1. 將胚狀體轉(zhuǎn)移至一15 ml 圓錐形管中放置3～5分鐘使胚狀體沉降下來。細胞被離心3分鐘會更好。放置使之沉降將會去除更多的單個細胞（包括死細胞）而這些細胞可以被離心下來。
2. 去除上清將胚狀體重懸于無鈣鎂離子的1xPBS中。
2. 離心3分鐘。
3. 去除上清加入1x胰酶（10 cm的培養(yǎng)皿加1 ml）。
4. 37℃水浴5分鐘。
5. 加入5 mlEB培養(yǎng)基小心吹打約10次。
6. 小心處理細胞很重要，進行細胞傳代分散細胞時不可劇烈吹打。
7. 離心2分鐘。
8. 吸出上清將細胞重懸于500 ul EB培養(yǎng)基。
9. 用光滑的巴斯德吸管小心吹打5次。
10. 離心2次。
11. 吸出上清將細胞重懸于100 ul EB培養(yǎng)基。
七、煙酸己可堿標記ES細胞進行移植
1. 準備一10 ug/ml的煙酸已可堿染液（雙苯酰亞胺，在冷凍室118）。
2. 加入1 mg（你能稱到的最小量）到5 ml EB培養(yǎng)基（制成200 ug/ml）。
3. 將溶液稀釋成10 ug/ml （100 ul 200 ug/ml 溶液和1.9 ml EB培養(yǎng)基）。
4. 如前所述將細胞重懸于2 ml煙酸已可堿染液而不是EB培養(yǎng)基中制備ES細胞懸液。
5. 將懸液置于室溫（或冰上）30分鐘。
6. 離心2分鐘。
7. 吸出上清將細胞重懸于2 ml EB培養(yǎng)基。
8. 重復一次。
9. 離心2分鐘。
10. 吸出上清將細胞重懸于100 ul EB培養(yǎng)基并置于冰上。
注意事項
1.需要采用高純度的水進行培養(yǎng)細胞。
2. 必須要在無菌的環(huán)境下操作實驗。
常見問題
1. 在沒有添加LIF的條件下，培養(yǎng)在飼養(yǎng)層上的ES細胞克隆形成率和AKP染色陽性度顯著高于無飼養(yǎng)層培養(yǎng)的ES細胞。
2. 在LIF添加量達到l000IU/ml時，外源LIF與飼養(yǎng)層產(chǎn)生的基質(zhì)型LIF在維持未分化狀態(tài)作用中存在有主從關(guān)系。
3. 當沒有外源LIF或量不足時，飼養(yǎng)層產(chǎn)生的分化抑制作用才會在分化抑制中發(fā)揮主要作用。
