大鼠星型膠質(zhì)細胞培養(yǎng)實驗-胰酶消化法
材料與儀器
SD大鼠
苯巴比妥 解剖液 胰蛋白酶 Dnase DM培養(yǎng)液
離心管 培養(yǎng)箱 手術器材
步驟
一、 取14.5d SD大鼠一只。
二、 苯巴比妥0.5 ml 腹腔注射，待麻醉后置于手術臺上，酒精棉球消毒皮膚，開腹取出子宮（約12-14個），放入解剖液中，剖開子宮，取出胚胎，放入解剖液中，在耳眼之間離斷，取頭側(cè)部組織，去除腦膜組織，取原始中腦區(qū)組織，放入離心管裝的解剖液中，待全部取出后，1500轉(zhuǎn)2分鐘。
三、 用吸管吸出上清液，在組織細胞沉淀中加入胰蛋白酶一管（1 ml/vial），室溫30分鐘，1500轉(zhuǎn)，離心5分鐘（離心前可加入解剖液以終止胰酶作用）。
四、吸去上清，在組織細胞沉淀中加入Dnase 一管（2 ml/vial），37℃反應10分鐘，1500轉(zhuǎn)，離心5分鐘，吸去上清，在組織細胞沉淀中加入2 ml DM培養(yǎng)液吹打，計數(shù)（計數(shù)公式為（N1+N2+N3+N4）/4x104），以3x105個/瓶在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，做好標記（時間、原代還是第幾代傳代，姓名，細胞名稱等），放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
注意事項
1. 麻醉藥劑量應梢大于普通用量。
2. 一定要仔細剔除干凈腦膜組織，否則會極大地影響培養(yǎng)細胞的純度。
3. 細胞培養(yǎng)技術不同于分子生物學，由于離心速度較慢，離心組織和細胞貼壁不如核酸緊密，取出離心后的上清液時一定要用吸管吸取，禁止用傾倒的方法。
4. 為保護胚胎，胚胎操作應在放置冰塊的托盤中進行，保持低溫。
5. 取中腦組織時應先用兩把鑷子夾住所取區(qū)域，然后用刀片切開。
6. 胰酶在細胞離心時會對細胞產(chǎn)生毒性，所以胰酶離心前可加入一定的解剖液稀釋。
7. 細胞離心時最好在冰凍離心機內(nèi)進行，以保持細胞活力。
8. 吹打細胞前用火燒吸管頭，發(fā)紅時逐漸后退，使吸管尖變鈍，減少吹打過程中對細胞的損害，實驗中也發(fā)現(xiàn)吹打時有一定的阻力。
9. 鼠胚胎較多時可分批消化，否則體外時間較長，細胞存活率低。
10. 用Neurobasal medium + B27。
11. 胰酶消化時加入EDTA可增強消化效果。
12. 關鍵在于取材的準確和原代細胞的狀態(tài)。
