細胞培養(yǎng)技術(shù)

原理

培養(yǎng)細胞傳代根據(jù)不同細胞采取不同的方法。貼壁生長的細胞用消化法傳代；部分貼壁生長的細胞用直接吹打可傳代；懸浮生長的細胞可以采用直接吹打或離心分離后傳代，或用自然沉降法吸除上清后，再吹打傳代。

材料與儀器

細胞
D-Hanks液 小牛血清 RPMI1640 雙抗 胰蛋白酶 EDTA NHCl NaHCO3
凈化工作臺 離心機 恒溫水浴箱 冰箱 倒置相差顯微鏡 培養(yǎng)箱 吸管 玻璃瓶 培養(yǎng)瓶 廢液缸 吸頭 槍頭 膠塞 離心管 量加樣槍 紅血球計數(shù)板

步驟

1.  貼壁細胞的消化法傳代：

（1）吸除或倒掉瓶內(nèi)舊培養(yǎng)液。

（2）D-Hanks液洗2～3次。

（3）向瓶內(nèi)加入適量消化液（胰蛋白酶或與EDTA混合液）輕輕搖動培養(yǎng)瓶，使消化液流遍所有細胞表面。
（4）然后吸掉或倒掉消化液后再加適量新的消化液，輕輕搖動再倒掉大部分消化液，僅留少許進行消化（也可不采用上述步驟直接加消化液進行消化）。

（5）消化最好在37℃或室溫25℃以上環(huán)境下進行。
（6）消化2～5 min 后把培養(yǎng)瓶放置顯微鏡下進行觀察，發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)回縮，細胞間隙增大后，應(yīng)立即終止消化。

（7）吸除或倒掉消化液，如用EDTA消化，需加Hanks液數(shù)毫升，輕輕轉(zhuǎn)動培養(yǎng)瓶把殘留消化液沖掉。
（8）再加培養(yǎng)液。如僅用胰蛋白酶可直接加少許含血清的培養(yǎng)液，終止消化。

（9）用彎頭吸管，吸取瓶內(nèi)培養(yǎng)液，反復(fù)吹打瓶壁細胞，吹打過程要順序進行。
（10）從培養(yǎng)瓶底部一邊開始到另一邊結(jié)束，以確保所有底部都被吹到，使細胞脫離瓶壁后形成細胞懸液。吹打時動作要輕柔不要用力過猛。 

（11） 計數(shù)，分別接種在新的培養(yǎng)瓶內(nèi)。

2.  懸浮細胞的傳代：懸浮細胞傳代可離心收集細胞后傳代，或直接傳代。

離心傳代法：

（1） 將細胞連同培養(yǎng)液一并轉(zhuǎn)移到15 ml 離心管內(nèi)。

（2） 離心800~1000 rpm，5 min。

（3） 棄去上清，加新的培養(yǎng)液到離心管內(nèi)，用吸管吹打形成細胞懸液。

（4） 計數(shù)，分別接種在新的培養(yǎng)瓶內(nèi)。

（5）直接傳代即讓懸浮細胞慢慢沉淀在瓶底后，將上清液吸掉1/2~2/3，然后用吸管吹打形成細胞懸液后再傳代。

3.  部分貼壁細胞的傳代

（1）部分貼壁不牢的細胞，如Hela細胞等，不經(jīng)消化處理直接吹打可使細胞從壁上脫落下來，而進行傳代。
（2）對絕大部分貼壁生長的細胞，因直接吹打?qū)毎麚p傷較大，細胞常有較大數(shù)量的丟失，因而需消化后，才能吹打傳代。

注意事項

1.  胰蛋白酶要預(yù)溫，溫度37℃左右為宜。

2.  離心轉(zhuǎn)速要合適，轉(zhuǎn)速過低，不能有效分離細胞，離心速度過大，時間過長，會擠壓細胞造成損傷甚至死亡。

3.  要定時觀察細胞，發(fā)現(xiàn)污染，應(yīng)及時處理。

常見問題

根據(jù)細胞生長的恃點，傳代方法有3種：懸浮生長細胞傳代、半懸浮生長細胞傳代（Hela細胞）、貼壁生長細胞傳代。

培養(yǎng)細胞傳代根據(jù)不同細胞采取不同的方法。貼壁生長的細胞用消化法傳代；部分貼壁生長的細胞用直接吹打可傳代；懸浮生長的細胞可以采用直接吹打或離心分離后傳代，或用自然沉降法吸除上清后，再吹打傳代。