細(xì)胞傳代實(shí)驗(yàn)-消化法
原理
用胰蛋白酶消化細(xì)胞，用于貼壁細(xì)胞傳代培養(yǎng)。
材料與儀器
細(xì)胞
胰蛋白酶 酒精 PBS
超凈工作臺(tái) 酒精燈 酒精棉球 培養(yǎng)箱 顯微鏡 吸管 離心管 離心機(jī)
步驟
一、傳代前準(zhǔn)備
1. 預(yù)熱培養(yǎng)用液：把已經(jīng)配制好的裝有培養(yǎng)液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴鍋內(nèi)預(yù)熱。
2. 用75%酒精擦拭經(jīng)過(guò)紫外線照射的超凈工作臺(tái)和雙手。
3. 正確擺放使用的器械，保證足夠的操作空間，不僅便于操作而且可減少污染。
4. 點(diǎn)燃酒精燈，注意火焰不能太小。
5. 準(zhǔn)備好將要使用的消毒后的空培養(yǎng)瓶，放入微波爐內(nèi)高火，8分鐘再次消毒。
6. 取出預(yù)熱好的培養(yǎng)用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超凈臺(tái)內(nèi)。
7. 從培養(yǎng)箱內(nèi)取出細(xì)胞，注意取出細(xì)胞時(shí)要旋緊瓶蓋，用酒精棉球擦拭顯微鏡的臺(tái)面，再在鏡下觀察細(xì)胞。
8. 打開(kāi)瓶口：將各瓶口一一打開(kāi)，同時(shí)要在酒精燈上燒口消毒。
9. 稍微搖搖，然后從對(duì)側(cè)倒掉培養(yǎng)液，用酒精棉球擦拭最后一滴，注意要靠近酒精燈。
二、胰蛋白酶消化
1. 加入消化液：用PBS清洗（沖洗），加入適量消化液（胰蛋白酶液），注意消化液的量以蓋住細(xì)胞最好，最佳消化溫度是37℃。
2. 顯微鏡下觀察細(xì)胞：倒置顯微鏡下觀察消化細(xì)胞，若胞質(zhì)回縮，細(xì)胞之間不再連接成片，表明此時(shí)細(xì)胞消化適度，然后讓其停止消化。
3. 倒掉消化液加入培養(yǎng)液，棄去胰蛋白酶液，加入新鮮的培養(yǎng)液。注意要在對(duì)測(cè)加入培養(yǎng)液。
三、吹打分散細(xì)胞
1. 吹打制懸：用吸管將已經(jīng)消化細(xì)胞吹打成細(xì)胞懸液。
2. 吸細(xì)胞懸液入離心管：將細(xì)胞懸液吸入10 ml 離心管中。
3. 平衡離心：平衡后將離心管放入臺(tái)式離心機(jī)中，以1 000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘。
4. 棄上清液，加入新培養(yǎng)液：棄去上清液，加入2 ml 培養(yǎng)液，用滴管輕輕吹打細(xì)胞制成細(xì)胞懸液。
四、分裝稀釋細(xì)胞
1. 分裝：將細(xì)胞懸液吸出分裝至2~3個(gè)培養(yǎng)瓶中，加入適量培養(yǎng)基旋緊瓶蓋。
2. 顯微鏡下觀察細(xì)胞：倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞量，必要是計(jì)數(shù)。注意密度過(guò)小會(huì)影響傳代細(xì)胞的生長(zhǎng)，傳代細(xì)胞的密度應(yīng)該不低于5x105/ml，最后要做好標(biāo)記。
五、傳代培養(yǎng)
用酒精棉球擦拭培養(yǎng)瓶，適當(dāng)旋松瓶蓋，放入CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。傳代細(xì)胞2小時(shí)后開(kāi)始貼附在瓶壁上。當(dāng)生長(zhǎng)細(xì)胞鋪展面積占培養(yǎng)瓶底面積25%時(shí)為一個(gè)+，占50%為++，占75%時(shí)為+++。
注意事項(xiàng)
1. 嚴(yán)格的無(wú)菌操作
2. 適度消化：消化的時(shí)間受消化液的種類(lèi)、配制時(shí)間、加入培養(yǎng)瓶中的量等諸多因素的影響，消化過(guò)程中應(yīng)該注意培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)的變化，一旦胞質(zhì)回縮，連接變松散，或有成片浮起的跡象就要立即終止消化。
附：0.25% 胰酶（胰蛋白酶，Trypsin）
配方：100 ml PBS，0.25 g 胰酶。
步驟：先配100 ml PBS。 稱(chēng)胰酶0.25 g。加入PBS中，低速攪拌。調(diào)pH7.4。過(guò)濾，分裝，-20℃保存，4℃短期內(nèi)用完。
注意：低速很重要，機(jī)械攪拌對(duì)酶是一種沖擊，如果起沫，酶就變性了。低溫，防止酶失活；對(duì)難消化的細(xì)胞，在上述配方中，加入0.02 g 的EDTA（0.02%）
常見(jiàn)問(wèn)題
根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)的恃點(diǎn)，傳代方法有3種：懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞傳代、半懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞傳代（Hela細(xì)胞）、貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞傳代。
培養(yǎng)細(xì)胞傳代根據(jù)不同細(xì)胞采取不同的方法。貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞用消化法傳代；部分貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞用直接吹打可傳代；懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞可以采用直接吹打或離心分離后傳代，或用自然沉降法吸除上清后，再吹打傳代。
