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PCR方法檢測病原微生物的材料與儀器及方法
發布日期:2024-08-26 08:19:30


PCR方法檢測病原微生物的材料與儀器及方法


多聚酶鏈反應(polymerase chain reaction,PCR)是一種模擬天然DNA復制過程,在體外擴增特異性DNA(或RNA)片段的新技術。本實驗是將待檢雙鏈DNA經94℃高溫變性成單鏈作模板,然后加入一對人工合成的寡核苷酸引物,引物分別與待擴增DNA片段的兩端互補,經55℃低溫退火,引物與模板互補結合。在72℃條件下,結合于模板上的引物在DNA聚合酶的催化下,利用反應體系中的4種dNTP為原料,按堿基互補配對的方式延伸合成兩條新的DNA鏈。經過20-30個周期后,特異的目的DNA可擴增百萬倍以上。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳后即可觀察到特異的擴增條帶。

PCR方法操作簡便,靈敏度高,可檢測出少至0.1pg的目的DNA。目前已廣泛應用于多種病原微生物及寄生蟲的檢測。

一、材料

1、無菌雙蒸水、石蠟油、溴化乙錠

2、10×PCR反應緩沖液

3、25mmol dNTP混合液

4、引物1,引物2各50pmol/u1

5、模板DNA

6、5U/ul Taq DNA聚合酶

二、儀器

1、PCR擴增儀

2、電泳儀

3、紫外線分析儀

三、方法

1、在0.5m1EP管中,加入以下成分:

10×PCR反應緩沖液 5u1

引物1 2ul

引物1 2ul

模板DNA 10u1

dNTP混合液 4ul

Taq DNA聚合酶 1ul

無菌雙蒸水加至 50ul

混勻, 加50 ul石蠟油,防止樣品水分蒸發。

2、將反應管置于PCR儀中,94℃變性4min。然后按94℃變性30s→55℃退火30s→72℃延伸1min,循環35次后,72℃延伸10 min。

3、反應完成后,取l0ul PCR擴增液,加至2%瓊脂糖凝膠中進行電泳,電壓100V,電泳30~60min后,置紫外線分析儀下觀查擴增結果。

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