酵母基因組DNA提取試劑盒的產品特點與應用研究
一、背景
酵母基因組DNA提取試劑盒采用DNA吸附柱和獨有的溶液系統，適合于從多種來源的酵母培養物中快速簡單地提取基因組DNA。約3ml處于指數生長期的酵母培養液一般一次抽提可純化出10-15μg的高質量的基因組DNA。純化DNA產物可直接用于PCR、酶切和雜交等實驗。
酵母細胞經lyticase處理去除細胞壁后，獨特的結合液/蛋白酶K迅速裂解細胞和滅活細胞內核酸酶，然后基因組DNA在高離序鹽狀態下選擇性吸附于離心柱內硅基質膜，再通過一系列快速的漂洗－離心的步驟，抑制物去除液和漂洗液將細胞代謝物，蛋白等雜質去除，最后低鹽的洗脫緩沖液將純凈基因組DNA從硅基質膜上洗脫。
二、原理
采用改進SDS-堿裂解法裂解細胞并結合破壁酶特異消化酵母細胞壁，能在1小時內從酵母培養液中分離出高純度質粒DNA。酵母收集后,加入破壁酶去除細胞壁后,然后堿裂法裂解細胞，離心吸附柱內的硅基質膜在高鹽、低PH值狀態下選擇性地結合溶液中的質粒DNA，再通過去蛋白液和漂洗液將雜質和其它細菌成分去除，最后低鹽、高PH值的洗脫緩沖液將純凈質粒DNA從硅基質膜上洗脫。
三、產品特點
1、離心吸附柱內硅基質膜全部采用進口世界著名公司特制吸附膜，柱與柱之間吸附量差異極小，可重復性好?？朔藝a試劑盒膜質量不穩定的弊端。
2、不需要使用有毒的苯酚等試劑，也不需要乙醇沉淀等步驟。
3、快速，簡捷，單個樣品裂解后操作一般可在30分鐘內完成。
4、多次柱漂洗確保高純度，OD260/OD280典型的比值達1.7～1.9，可直接用于PCR，Southern-blot和各種酶切反應。
四、注意事項
1、樣品應避免反復凍融，否則會導致提取的片段較小且提取量下降。
2、若試劑盒中的溶液出現沉淀，可在65度水浴中重新溶解后再使用，不影響提取效果。
3、洗脫緩沖液的體積好不少于50ul，體積過小會影響回收效率；洗脫液的值對洗脫效率也有影響，若需要用水做洗脫液應保證其pH值在8.0左右可用NaOH將水的pH值調至此范圍值低于7.0會降低洗脫效率。DNA產物應保存在-20℃，以防降解。
五、應用
酵母基因組DNA提取試劑盒可用于酵母基因組DNA提?。?/span>
在光滑球擬酵母基因組規模生物模型的構建與應用研究中以丙酮酸工業生產菌株Candida glabrata CCTCC M202019為研究模型,在完成全基因組測序、基因組功能注釋和比較基因組學研究的基礎上,構建了基因組規模代謝網絡模型(Genome-scale metabolic model,GSMM)、轉錄調控網絡模型(Transcriptional regulatory network,TRN)和工業微生物輔因子代謝網絡模型(Genome-scale cofactor metabolic model,GSCMM)。
結合上述基因組規模生物模型,運用基于約束的優化算法,從基因、代謝、轉錄、輔因子等層面上解析了C.glabrata的生理特征(如丙酮酸的高產、低致病性相關的生物安全性等),并發展了優化其生產性能(如丙酮酸、富馬酸等丙酮酸去路中代謝物)的方法。
主要研究結果如下：
1、運用二代高通量測序技術,對C.glabrata CCTCC M202019進行全基因組測序,其基因組特征包括:12.1 Mbp基因組大小、38.47%GC含量、5345個基因、191個t RNA、6個r RNA和1.15%的重復序列等。與C.glabrata CBS138進行比較基因組分析,發現雖然兩菌基因組具有高度相似性,但也存在差異如:中心碳代謝(營養物質和二羧酸的轉運、氧化磷酸化和丙酮酸分解代謝)和黏附性代謝(凝集素蛋白的低復雜度重復區和功能結構域的缺失和變化)。
在此基礎上,借助在四種培養基上的丙酮酸發酵實驗、哥倫比亞血平板上生長實驗、96孔微孔板內壁和內皮細胞的黏附實驗,證明了C.glabrata CCTCC M202019比CBS138菌株具有更強的丙酮酸生產能力和更弱的黏附性和細胞毒性。
2、根據C.glabrata氨基酸序列、文獻挖掘和專業數據庫,構建了C.glabrata的GSMM i NX804。模型i NX804包括804個基因、1025個代謝物和1287個生化反應,分布于細胞質、線粒體、過氧化物酶體、高爾基體、液泡和胞外區間。
