Percoll不連續(xù)密度梯度沉淀法分離純化淋巴細(xì)胞和淋巴母細(xì)胞

原理

Percoll是一種包有乙烯吡咯烷酮的硅膠顆粒。滲透壓很低（<20 mosm/kg H2O）， 粘度也很小，可形成高達(dá)1.3 g/ml密度，采用預(yù)先形成的密度梯度時可在低離心力（200～1000 g）于數(shù)分至數(shù)十分鐘內(nèi)達(dá)到滿意的細(xì)胞分離結(jié)果。由于Percoll擴(kuò)散常數(shù)低，所形成的梯度十分穩(wěn)定。此外，Percoll不穿透生物膜，對細(xì)胞無毒害，因此廣泛用于分離細(xì)胞、亞細(xì)胞成分、細(xì)菌及病毒，還可將受損細(xì)胞及其碎片與完好的活細(xì)胞分離。

材料與儀器

Percoll
PBS 血清
試管 注射器 離心機(jī)

步驟

1.  不同濃度（密度）Percoll溶液的制備
先用9 份Percoll與1 份8.5 ％ NaCl或1.5 MPBS混合達(dá)到生理性滲透壓，然后用生理溶液（0.85 ％ NaCl或0.15 M PBS）稀釋到所需濃度。

Percoll濃度（％）　70　　　60　　　  50　　　40　     　 30　　　    20

比重（g/ml）　　1.090      1.077       1.067        1.056         1.043         1.031

2.  不連續(xù)密度梯度Percoll層的制備
先將試管壁用牛血清濕潤，除去多余血清，這種預(yù)處理可使逐層疊加的Percoll液平穩(wěn)沿管壁流下，使形成滿意的界面。在制備過程中一般用長針頭注射器從高密度向低密度逐層放置，有時相鄰兩層Percoll比重相差不大時，可將Percoll液放入注射器中，小針頭斜面緊貼管壁，任其自然慢慢流下。　

3.  裝樣
樣品體積和細(xì)胞濃度根據(jù)不同細(xì)胞而異，一般加樣體積不宜過大，細(xì)胞濃度也不可過高，否則會影響細(xì)胞的分離和回收。　

4.  離心
一般采用離心力為400 g，時間20～25 min。由于多層Percoll之間密度差別不大，因此離心機(jī)加速、降速時要慢，要平穩(wěn)。

5.  取樣
當(dāng)所要分離的細(xì)胞絕大部分在兩層的界面時，可逐層去除Percoll液后收集界面部位的細(xì)胞；有時大部分細(xì)胞位于Percoll層中，則需要逐層收集。收獲含有Percoll液的細(xì)胞經(jīng)2 次洗滌后可供培養(yǎng)或檢測用。

常見問題

一、分離純化細(xì)胞舉例　

1.  富含NK活性大顆粒淋巴細(xì)胞（LGL）的純化
按順序由下向上逐層加50 ％、47.5 ％、45 ％、42.5 ％和40 ％五種不同密度的Percoll，如用10 ml試管（或塑料管）分離，每層Percoll約1.2～1.5 ml，初步從外周血中分離的PBMC細(xì)胞1×108懸于1 ml培基中，按要求裝樣、離心和取樣。一般富含NK殺傷活性的LGL細(xì)胞位于42.5％與45％Percoll界面以及上下二層的Percoll液中。

2.  純化淋巴母細(xì)胞和除去死細(xì)胞
分別疊加50 ％和30 ％Percoll液。收取經(jīng)PHA（或其它抗原、有絲分裂原）刺激PBMC，或含有較高比例異型的PBMC（如腎綜合征出血熱患者），按要求裝樣、離心和取樣。位于管底的淋巴細(xì)胞為小淋巴細(xì)胞；兩層Fercoll之間為淋巴母細(xì)胞，純度和回收率在80％以上，位于30 ％Percoll表面是死細(xì)胞。收獲淋巴母細(xì)胞可進(jìn)行表型、結(jié)構(gòu)以及功能的研究。

二、人不同血細(xì)胞的漂浮密度 

人不同血細(xì)胞的漂浮密度
細(xì)　胞　　　    漂浮密度　       
紅細(xì)胞　　       1.09-1.11　

粒細(xì)胞　　　
嗜酸性　　       1.09-1.095 
嗜中性　　       1.080-1.085　　 

單核細(xì)胞　       1.050-1.066
血小板　　       1.030-1.060
淋巴細(xì)胞　　    1.052-1.077
B淋巴細(xì)胞　     1.062-1.075　　

T淋巴細(xì)胞　     1.065-1.077
淋巴母細(xì)胞　    1.065-1.077
自然殺傷細(xì)胞    1.050-1.070