活細胞免疫熒光技術－流式細胞儀標本的制備

原理

活細胞表面保留有較完整的抗原或受體，先用特異性鼠源性單克隆抗體與細胞表面相應抗原結合，再用熒光標記的第二抗體結合，根據所測定的熒光強度和陽性百分率即可知相應抗原的密度和分布。

材料與儀器

抗體 血清
RPMI1640 DPBS 洗滌液 固定液
玻璃管 塑料管 離心機 顯微鏡

步驟

1.  制備活性高的細胞懸液（培養細胞系、外周血單個核細胞、胸腺細胞、脾細胞等均可用于本法）　　　　　　　　　　　　　　　

2.  用10 ％FCS RPMI1640調整細胞濃度為5×106～1×107 /ml　　　　　　　

3.  取40 μl細胞懸液加入預先有特異性McAb（5～50 μl）的小玻璃管或塑料離心管，再加50 μl 1∶20（用DPBS稀釋）滅活正常兔血清，4 ℃ 30 min　　　　　　　　

4.  用洗滌液洗滌2 次，每次加洗滌液2 ml左右，1000 rpm×5 min　　　　　　　　

5.  棄上清，加入50 μl工作濃度的羊抗鼠（或兔抗鼠）熒光標記物，充分振搖，4 ℃ 30 min　　　　　　　　　

6.  用洗滌液洗滌2 次，每次加液2 ml左右，1000 rpm×5 min　　　　　　　　　　　　　　　　

7.  加適量固定液（如為FCM制備標本，一般加入1 ml固定液，如制片后在熒光顯微鏡下觀察，視細胞濃度加入100～500 μl固定液）　　　　　　　　　　　

8.  FCM檢測或制片后熒光顯微鏡下觀察（標本在試管中可保存5～7 天）　

注意事項

1.  整個操作在4 ℃下進行，洗滌液中加有比常規防腐劑量高10倍的NaN3，上述實驗條件是防止一抗結合細胞膜抗原后發生交聯、脫落。　　

2.  洗滌要充分，以避免游離抗體封閉二抗與細胞膜上一抗相結合，出現假陰性。　

3.  加適量正常兔血清可封閉某些細胞表面免疫球蛋白Fc受體，降低和防止非特異性染色。　

4.  細胞活性要好，否則易發生非特異性熒光染色。

常見問題

一、附錄　

1.  DPBS （×10， 貯存液）

NaCl 80 g，KCl 2 g，蒸餾水加至1000 ml，Na2HPO4 11.5 g，臨用時用蒸餾水1∶10稀釋，KH2PO4 2 g　

2.  洗滌液 

DPBS 900 ml，FCS 50 ml（終濃度5 ％），4 ％ NaN3 50 ml（終濃度0.2 ％）

3.  固定液

DPBS 1000 ml，葡萄糖 20 g（終濃度2 ％），甲醛 10 ml，NaN3 0.2 g （終濃度0.02 ％）