堿性磷酸酶-抗堿性磷酸酶（APAAP）免疫組化染色技術(shù)檢測淋巴細胞表面標(biāo)記

原理

APAAP（Alkaline phosphatase-anti-alkaline phosphatase technique）技術(shù)的基本原理為：抗鼠IgG抗體作為橋梁，將鼠源性識別細胞抗原的第一抗體與鼠源性的抗堿性磷酸酶單克隆抗體-堿性磷酸酶復(fù)合物相連接，使之成為Ag，-Ab1－Ab2-anti AP-AP的復(fù)合物。還可通過二抗將APAAP 復(fù)合物重復(fù)疊加起來，從而使多個堿性磷酸酶標(biāo)記于組織細胞上第一抗體所識別的抗原部位，提高了敏感性。

材料與儀器

APAAP
TBS 固定液
載玻片 制片機 濕盒 顯微鏡

步驟

1.  分離外周血單個核細胞（PBMC），洗滌后用含10 ％FCS PMI1640調(diào)整細胞濃度約5×106 /ml　　

2.  自制制片機上制片，充分干燥　　　　　　　

3.  用含丙酮-福爾馬林固定液中固定30 秒鐘　　　　　　　　　　　　　　

4.  自來水、蒸餾水依次沖洗　　　　　　　　　　　　　　

5.  用TBS稀釋特異性McAb或陰性對照抗體（1∶50～500），每片加30～50 μl　　　　　　　　　　　　　

6.  室溫濕盒孵育30 min，或4 ℃冰箱濕盒中過夜　　　　　　　　　　　　　　　

7.  充分用TBS沖洗后，加1∶50羊（兔）抗鼠IgG（GAM或RAM IgG）30～50 μl　　　　　　　　　　　　　　　　

8.  室溫濕盒孵育30 min　　　　　　　　　　　　　　　

9.  TBS沖洗后加堿性磷酸酶-抗堿性磷酸酶（1∶2000）復(fù)合物（APAAP）　　　　　　　　　　　　　　　

10.  TBS沖洗后可重復(fù)疊加GAM或RAM IgG和APAAP2 次，每次孵育10 min　　　　　　　　　　　　　　　

11.  沖洗后底物液顯色10～15 min　　　　　　　　　　　　　　　

12.  自來水沖洗，蘇木精襯染，光鏡下觀察

注意事項

1.  細胞表面抗原的強度以新鮮分離細胞制片、固定為好。若需保存最好干燥密封貯存于-20 ℃低溫冰箱中，使用前必須充分干燥后固定。　

2.  APAAP中堿性磷酸酶和抗堿性磷酸酶的比例非常重要，抗體濃度過高，易封閉橋抗影響染色結(jié)果。

3.  一抗、橋抗和APAAP復(fù)合物使用的濃度視細胞表面抗原密度而定，每步洗滌要充分。