免疫細胞化學技術觀察細胞成分法

原理

免疫細胞化學是在細胞化學技術的基礎上，吸收免疫學的理論和技術發展起來的一項技術，其基本原理是用熒光素或酶等標記物或顯色物標記特異性抗體，通過免疫學中的抗原抗體反應與細胞內的相應抗原結合，形成帶有熒光素或顯色物的抗原抗體復合物，因此可用熒光顯微鏡或普通光學顯微鏡觀察到復合物的存在，達到檢測細胞內抗原物質的目的。細胞免疫化學是一項綜合性的技術，包括標本的準備（制備、儲存、固定等）、染色方法以及結果的分析判斷，非特異性染色的減輕、消除等。

材料與儀器

細胞
福爾馬林 丙酮 多聚甲醛
蓋玻片 培養瓶 培養板

步驟

一、標本制備

細胞可直接培養在蓋玻片上、培養瓶內或培養板上，也可將一定量的細胞收集離心制成涂片。

二、固定和固定制

對于活細胞標本，常用的固定劑有以下幾種。

1.  福爾馬林類

10 %福爾馬林或10 %中性福爾馬林，其中以10 %中性緩沖福爾馬林固定效果最好，最為常用。

2.  丙酮類

純丙酮固定效果好，對抗原的影響也較小，95 %乙醇的固定效果與丙酮相似但不如丙酮好。如在乙醇中加入1 %冰醋酸可增強固定效果，加入少量氯仿可有利于抗體的穿透。

3.  4 %多聚甲醛類

將多聚甲醛40 g溶于0.1 M PBS 1000 ml，加熱至60 ℃左右，邊攪拌邊加溫至透明為止（一般需滴加少許1 M NaOH才能使溶液清亮）。該固定劑較溫和，適于標本的較長期保存。

目前尚未發現一種通用的固定劑，對各種不同的抗原都有滿意的固定效果。比較而言，中性緩沖甲醛是適用性較廣的一種固定液。必要時，可用多種固定液作比較，從中挑選出對某種抗原效果最好的固定液。

注意事項

1.  活細胞標本制備好后應立即固定，以防止細胞自溶，保持其固有的組織結構，保存細胞內的抗原性，使抗原不失活，不發生彌散和保證免疫組化定位準確。標本固定后必須徹底清洗、除去多余的固定液，否則將影響免疫組化染色效果。

2.  一般固定劑以室溫（22℃）為宜，某些酶的固定，要求在37 ℃下進行。固定時間因固定劑、溫度及抗原成分等因素的不同而異。時間過短，固定不充分，影響抗原保存的完好性，但也不是越長越好，時間過長亦會對抗原、細胞形態有影響，從而影響免疫組化效果，所以應該掌握適當。固定時間：酒精、丙酮5～15 分鐘，多聚甲醛3～5分鐘，福爾馬林10～15 分鐘。