培養神經元的支持物的制備

材料與儀器

濃硝酸
玻璃蓋玻片 層流柜

步驟

一、蓋玻片的預處理

1. 玻璃蓋玻片放在瓷染色架上，用蒸餾水沖洗。

2. 架子放在玻璃容器中，濃硝酸泡 48 小時。

3. MilliQ 水漂洗蓋玻片 1 小時，重復 3 次。

4. 200℃ 烤 8 小時滅菌蓋玻片。

5. 在層流柜中將蓋玻片放在 60 mm 培養皿，外邊緣放兩粒（1~2 mm 高）融化的無菌 Paraplast。顆粒的大小決定了蓋玻片和培養皿單層神經膠質細胞間的分離程度。

6. 加入 5 ml 過濾除菌的溶于硼酸緩沖液（0.1 mol/L，pH 8.5）的 1 mg/ml poly-L-lysine 溶液，室溫過夜。

7. 無菌 MilliQ 水漂洗 1 小時。重復 3 次。

8. 吸出漂洗液，加 5 ml 接種培養基（MEM 加 10% 馬血清），接種分離神經元之前放在 CO2 溫箱中 37℃ 孵育至少 24 小時。

二、單層神經膠質細胞的制備

1. 去掉 1~3 天幼大鼠的頭。

2. 在層流柜中從頭顱骨上取下腦，放在盛有 BSS 的培養皿中。

3. 在解剖顯微鏡下取出腦半球，完全剝離腦膜、切碎腦組織，放入盛有 25 ml 0.25% 胰酶 BSS 溶液的 50 ml 組織培養管。

4. 37℃ 水浴孵育 30 分鐘。

5. 小心吸出胰酶溶液，加 25 ml BSS，用巴斯德吸管吹散細胞。

6. 離心收集細胞（1000 r/min，10 分鐘），懸于接種培養基中。

7. 計數細胞，懸液稀釋至 200000 細胞/ml，取 4 ml 接種 60 mm 組織培養皿。

8. 24 小時后倒掉培養液，加 5 ml 新鮮培養液。

9. 每周換一次培養液，神經膠質細胞 70% 長滿時即可用于共培養。

10. 制備神經元培養物時，提前一天更換神經元培養液，加 6 ml 維持培養液繼續培養。