光學及熒光顯微術

材料與儀器

細胞懸液
Lenkostat Hoechst 33258 吖啶橙 溴化乙錠
光學顯微鏡 熒光顯微鏡

步驟

一、旋轉細胞制備的 Lenkostat 染色
1. 在轉瓶小室中加入 100 μl 細胞懸液，500 r/min 離心 2 分鐘。載玻片風干至少 5 分鐘。

2. 在 Lenkostat 固定液中固定細胞 10 秒：2 mg/ml 孔雀石綠溶于 100% 甲醇?？傻稳?。

3. 載玻片在 Lenkostat 溶液 1 中浸 10 秒鐘使細胞質染色：0.1% 依紅；0.1% 甲醛；0.4% 磷酸氫二鈉；0.5% 磷酸二氫鉀?？捎眉埥砦伞?br style="box-sizing: border-box; border: 0px solid; --tw-border-spacing-x: 0; --tw-border-spacing-y: 0; --tw-translate-x: 0; --tw-translate-y: 0; --tw-rotate: 0; --tw-skew-x: 0; --tw-skew-y: 0; --tw-scale-x: 1; --tw-scale-y: 1; --tw-pan-x: ; --tw-pan-y: ; --tw-pinch-zoom: ; --tw-scroll-snap-strictness: proximity; --tw-gradient-from-position: ; --tw-gradient-via-position: ; --tw-gradient-to-position: ; --tw-ordinal: ; --tw-slashed-zero: ; --tw-numeric-figure: ; --tw-numeric-spacing: ; --tw-numeric-fraction: ; --tw-ring-inset: ; --tw-ring-offset-width: 0px; --tw-ring-offset-color: #fff; --tw-ring-color: rgba(59,130,246,.5); --tw-ring-offset-shadow: 0 0 #0000; --tw-ring-shadow: 0 0 #0000; --tw-shadow: 0 0 #0000; --tw-shadow-colored: 0 0 #0000; --tw-blur: ; --tw-brightness: ; --tw-contrast: ; --tw-grayscale: ; --tw-hue-rotate: ; --tw-invert: ; --tw-saturate: ; --tw-sepia: ; --tw-drop-shadow: ; --tw-backdrop-blur: ; --tw-backdrop-brightness: ; --tw-backdrop-contrast: ; --tw-backdrop-grayscale: ; --tw-backdrop-hue-rotate: ; --tw-backdrop-invert: ; --tw-backdrop-opacity: ; --tw-backdrop-saturate: ; --tw-backdrop-sepia: ; line-height: 1.625rem !important;"/>
4. 載玻片在 Lenkostat 溶液 2 中浸 10 秒復染細胞質：0.04% 亞甲藍；0.04% 天青 A；0.4% 磷酸氫二鈉；0.5% 磷酸二氫鉀。沖去多余染料，風干載玻片。

5. 在光學顯微鏡下觀察確定是否獲得了所需染色。如是，可用 Pemount 制作載玻片標本。

6. 如要測定凋亡數量，應放大 40 倍觀察。至少應分析包括約 100 個細胞的 3 個視野，給出凋亡和壞死的百分率。

二、懸浮細胞 Hoechst 33258 染色
1. 用 1 μl Hoechst 33258 孵育 100 μl 懸浮細胞 10 分鐘。

2. 樣品加入轉瓶小室中，500 r/min 離心 2 分鐘，空氣干燥后在細胞上加蓋玻片，以減小光衍射，用裝備有 DAPI 濾光片的熒光顯微鏡計數至少 300 個細胞，使用 60 倍物鏡。

三、吖啶橙/溴化乙錠（AO/EB）染色
1. 用 1 μl AO/EB 溶液孵育 25 μl 懸浮細胞。輕輕混合。每個樣品顯微定量前應混合。樣品必須立即測評。

2. 置 10 μl 懸浮細胞于顯微載玻片上，加蓋玻片，用裝有熒光濾光片、60 倍物鏡的熒光顯微鏡檢測至少 300 個細胞。