活細胞表面抗原的熒光染色（間接免疫熒光）

材料與儀器

細胞
PBS 溶液 疊氮化鈉

步驟

1. 在培養皿中加入 1 mmol/L EDTA/1 mmol/L EGTA 的 PBS 溶液，收獲細胞。此程序比通常的胰蛋白酶消化時間長。4℃ 1000 g 離心 5 分鐘。操作始終在冰上進行。

2. 用 4 ml PBS+0.1% 疊氮化鈉和 1% BSA 或熱的滅活血清洗細胞。

3. 計數細胞，每個樣品的最小濃度為 1X106/ml。

4. 將樣品等分為 50 μl 小體積的含 0.1% 疊氮化鈉和 1% 熱的滅活血清的 PBS 溶液。

5. 加合適滴度的初始抗體，用系列稀釋確定合適滴度范圍。

6. 在冰上孵育細胞 30 分鐘。

7. 每個樣品中加入 4 ml PBS+疊氮化鈉和 BSA，輕輕混合。

8. 1000 g 離心細胞 5 分鐘。

9. 用 4 ml PBS+疊氮化鈉和 BSA 洗樣品。

10. 1000 g 離心細胞 5 分鐘。

11. 在適當體積的 PBS+疊氮化鈉中重懸細胞。

12. 加合適滴度的次級抗體，用與起始滴度相近的范圍確定所需量。

13. 在冰上孵育細胞 30 分鐘。

14. 每個樣品中加入 4 ml PBS+疊氮化鈉和 BSA，輕輕混合。

15. 1000 g 離心細胞 5 分鐘。

16. 在相近體積的 PBS+疊氮化鈉和 BSA 中重懸細胞，終濃度為 1X106~5X106 /ml。