從標記的細胞或者細胞裂解物中提取ATP

步驟

1.從標記細胞提取ATP

1)  備下列材料：

本實驗用到的所有溶液必須用Mlli - Q純化的水或它的等價物配制。

冰冷的4%高氣酺（v/v)

三-n-辛胺

1,1,2-三氮三m乙烷

32p標記的細胞

帶螺帽的聚丙烯離心管

測量范圍PH4~8的PH試紙

小心：高氣酸■ 三-n -辛胺； U  1，2-三氯三氟乙燒；放射性物質(zhì)（見附錄5)2) 從標記細胞中吸出培養(yǎng)基，用PBS清洗兩次。徹底吸去清洗液，將細胞放入冰盒。

迅速加入〇.5ml冰冷的4%高氯酸，輕輕混勻以裂解細胞，冰浴5分鐘s將細胞到入酸液，定量轉(zhuǎn)移至一個帶螺帽的離心管。于4尤全速離心5 分鐘以沉淀細胞碎片。3) 將上清轉(zhuǎn)移至新的離心管，放入冰浴。按 1.2比1的比例新鮮配制三- n -辛胺與1,】，2_三氯三氟乙烷的混合物，混勻。加0.6ml混合物到高氯酸樣品，蓋緊螺帽，用旋渦混合器振蕩1分鐘以上。

此時一定要充分混勻，以確保完全中和。

4 ) 完全混勻后，室溫離心5分鐘Q

離心后溶液明顯地分成三層。底y是過屆:的二-n -辛咹/I, I，2--:氣二氟乙烷，屮M是高氯酸辛胺（這 -層通常呈黃色），1：層水相是己中和的樣品。

5) 吸出上層到新離心管，用PH試紙測pH值。pH值應(yīng)是PH6~73如果樣品f_H值低于6,則重復(fù)用-:-n-卡胺/I，丨，2 三氣三婕乙烷處理；這種情況很少見。

此時樣品句以進行分析了   管用什么方法，都要有已知A1P濃度的標準樣品與測試樣品平行用二- ? -辛胺< 24J ■   /U〖，2_—氣三M己坑提取。

2.從細胞裂解物中提取ATP

從細胞裂解物中提取ATP，按上述方法做以下修改即可。

1) 準備下列材料：

標記的細胞裂解物

冰冷的8%高氯酸（v/v)

-辛胺

1，1，2_三氯三氟乙烷

帶密封蓋子的5-ml聚丙烯離心管

2) 在一個5-ml聚丙烯離心管里，往裂解物中加等量的冰冷的8%高氯酸，放于冰上。

徹底混勻，冰浴5分鐘D于4^：離心5分鐘或者直至蛋白質(zhì)完仝沉淀。將 h清吸出到一個新離心管，按上述基本方法屮和53)  蛋白質(zhì)沉淀后的樣品中加1.2倍體積三-re-辛胺/I,2_三氯三氟乙烷，用旋渦混合器充分振蕩。然后完全按上述基本方法繼續(xù)實驗。