測定[γ-32P]ATP的比活性

步驟

準備下列材料：

含有未知濃度mp] ATP的細胞裂解物樣品

10mg/ml激酶底物肽漸夜（Calbiochem)

0.5mraol/L cAMP 溶液 I、Calbiochem)

cA-PrK (Calbiochem)

cA-PrK分析緩沖液

lmol/L DTT儲存液（^ 2〇尤保存）

0.5mol/LMg〇2

75mmol/L 正磷酸

Whatman P81確酸纖維素濾紙

丙酮

循環水浴

旋渦混合器

小心：強酸和強喊；IHT;  MgCl2;丙酮（見附錄5)

這_.使用的方法學在下-竹奮更詳細的:敘述。CA-PrK分析的細f 4 分析緩沖液和底物的制備/K這里也會講到2) 將一系列要進行試驗的離心管貼上標簽。將Wlmt_   P81濾紙切成1英寸的方塊,與離心管對應地做上標記（PS1方塊的制備見第29節)。

3) 將離心管放在冰上，加入下列成分

25^1含 [32P] ATP的裂解液

5fil l〇x分析緩沖液

l(il 0.5mmol/L cAMP

5W 10mg/ml激酶底物肽

1/zl lmol/L D1T

l^tl 0,5ni〇l/L MgCl2

2^1水

4) 所有離心管都加好以后，蓋上蓋子，冰浴。

5) 每30秒加入1(^1 cA-PrK溶液，放入301水浴開始反應。

按這樣的時間安排進行實驗可以經驗件地確定合適的反映時間r 60、120, 180弓200分鐘都要試一K,選定的時間應_321~8gt~J摻入激醻底物肽的平臺期之后。

6) 從每管吸出3〇4到對應的P8]濾紙塊表面D立即將濾紙放入含75mmoI/L正磷酸的燒杯。所有反應都如此處理過以后，沖洗P81濾紙5分鐘。將磷酸溶液倒入裝t 32P的廢液的容器。再往燒杯中加入正磷酸，攪拌5分鐘。如此沖洗P81濾紙5次。7) 往燒杯中加入丙酮，再沖洗5分鐘u 倒掉肉酮，讓四1濾紙在室溫自然晾干：8) 將每一塊P81濾紙放入20ml的液閃計數管，用液閃計數器測定放射性。