懸浮培養(yǎng)細胞的透化

材料與儀器

懸浮培養(yǎng)物
胞外緩沖液 ATP 儲存液

步驟

1. 約在實驗開始前 1 小時，用 50 ml 滅菌試管以 1000 g 離心懸浮培養(yǎng)物 5 分鐘，用 40 ml 左右胞外緩沖液清洗細胞兩次。用預(yù)熱至 37℃ 的胞外緩沖液重懸細胞至 107 細胞/ml。于 37℃ 輕輕搖動 15~30 分鐘，讓細胞達到平衡。

2. 1000 g 離心 5 分鐘，吸去緩沖液。往新鮮透化緩沖液中加鏈球菌溶血素 O 至每毫升 0.6 單位，該溶液已先加了冷 ATP 至100 μmol/L 進行預(yù)平衡。將這透化溶液加入細胞中，輕輕地混勻。

3. 于 37℃ 溫育 1~5 分鐘。

4. 加 [γ-32P] ATP 儲存液至終濃度 50~500 μCi/ml。

5. 加入要研究的實驗試劑，如藥理試劑、多肽、Fab' 片段，放置一段時間讓它們發(fā)揮作用。

6. 加入所需的受體激動劑。

7. 制備免疫沉淀樣品或者 PAGE 樣品。

(1) 加入等量冰冷的 2X 裂解緩沖液終止反應(yīng)。往裂解緩沖液中加蛋白酶抑制劑儲存液；如加 PMSF 至終濃度 1 mmol/L，加的抑胃酶肽 A、亮抑酶肽及抗蛋白酶各 5 μg/ml，以及加 DTT 至 1 mmol/L。冰浴 10 分鐘。

(2) 于 4℃ 全速離心裂解液，將上清吸到新離心管中。