朊粒病的標本類型和處理

簡介

骯粒（Prion，PrPS ）又名脈病毒、骯毒體， 是一類由宿主細胞基因編碼， 構象異常的蛋白，其不含核酸， 抵抗力強， 具有自我復制能力和傳染性， 可引起多種哺乳動物發生傳染性海綿狀腦病（transmissible spongiform encephalopathies，TSEs）， 如羊瘙癢病、克雅病、庫魯病、瘋牛病等。目前在人類及20余種動物中發現有10多種自然發生或感染的玩粒病。

原理

傳染性海綿狀腦病（TSEs）即骯粒病， 是一種慢性退行性、致死性中樞神經系統疾病。不同來源的阮粒可呈現出明顯的「毒株」差異， 如在潛伏期、臨床特征， 神經病理表現以及玩粒的分子特征等方面有所不同。一般來說， 骯粒病共同特點包括：

① 潛伏期長， 可達數年或數十年；

② 發病后呈慢性、進行性發展， 死亡率100％；

③ 臨床表現以癡呆， 震顫、共濟失調等中樞神經系統癥狀為主；

④ 病理學特點表現為中樞神經系統神經元死亡， 彌漫性神經元缺失， 星狀膠質細胞增生， 腦皮質疏松呈海綿狀變性并有淀粉樣斑塊形成， 腦組織無炎癥反應。

材料與儀器

（一）標本類型

凍存腦組織

步驟

朊粒病的標本類型和處理的步驟有以下幾步：

實驗前， 取出凍存腦組織， 室溫解凍后， 在生物安全柜中， 用采樣器在腦干一側采集神經組織， 稱重定量。因骯粒病病原及其引起的損害的重點部位在腦干的延髓（腦門）， 故采樣部位最好為延髓； 也可分別采集多部位（延髓、腦橋、中腦、丘腦、大腦皮質、小腦組織）同時檢測。

采樣完后另一半腦組織需完整保存于－80 ℃， 用于復檢和確診。在待測樣本中加入 PBS 緩沖液， 通過勻漿， 超聲處理， 使之成為10％（WIV）的腦組織懸液。將一定量上述腦組織懸液與等體積預冷裂解緩沖液混勻， 低速離心后， 取上清液（即「樣品產」） 進行蛋白酶 K 處理（如37 ℃ 消化 1 小時）， 以破壞對蛋白酶K敏感的 PrP。用苯甲基磺酰氟（PMSF）終止蛋白酶K反應后所獲得的樣品即為「樣品一」。

此外， 還可采用甲酸、SDS 等處理標本提取物， 以促進 PrPS 分子表位的暴露， 再進行抗原抗體反應。

注意事項

① 所有樣品的處理過程均需遵守相關生物安全規程， 如標本處理需要在 2 級或 3 級生物安全柜中進行； 操作中盡量避免氣溶膠產生， 避免刺傷、劃傷。

② 由于不同類型阮粒病的腦組織 PrP「含量不同， 對蛋白酶 K 的抵抗力也不相同。因此， 除了對蛋白酶 K 消化條件進行優化外， 還應在實驗前對樣本進行初步判斷， 以確定蛋白酶 K 的用量。例如： 對于 sCJD 患者， 蛋白酶 K 工作濃度一般為 20 ug/ml， 時間為 1～2 小時， 而對于 FFI 患者， 蛋白酶 K 的工作濃度一般為 5 ug/ml， 且消化時間不超過 30 分鐘。

③ 待測樣本應與陽性對照（瘋牛病牛腦組織）陰性對照（健康牛腦組織）同時處理。