動物病毒毒力測定實驗

原理

溶細胞性病毒的毒力與其致細胞病變的能力直接相關，固可用不同含量的病毒液接種敏感的宿主細胞培養物測定毒力。實驗中病毒的毒力以其致細胞病變效應（cytopathic effect CPE）的程度確定，即觀察病毒致細胞病變的最高和最低量，以半數細胞病變為病毒感染劑量。然而，實驗中所能觀察到的是不同稀釋病毒致細胞病變的定性結果，需要將結果統計處理，用 Reed-Muench 公式計算，才能獲得病毒 TCID50 的相對定量（滴度或效價）。

該病毒的 TCID50 在 10-3 和 10-4 稀釋度之間。

根據 Reed-Muench 公式 TCID50＝高于 50％ CPE 百分率病毒稀釋度的對數＋比距×稀釋因子的對數（1）式中，比距＝(高于 50％ CPE 百分率-低于 50)/(高于 50％ CPE 百分率-低于 50％CPE 百分率) （2），將表 1 的數值代（2）式中，則比距＝(91.6-50)/(91.6-40) =0.8。再將比距值代入（1）式中，lg10-3+0.8×lg10-1=-3.8，則 lg TCID50=-3.8，即 TCID50=10-3.8。查反對數得 6310，即該病毒 6310 倍稀釋液 0.1 ml 等于 1 個 TCID50。

材料與儀器

甲型流感病毒（Influenza virus A） 傳代犬腎細胞系 MDCK（Canis familiaris）
DMEM 細胞培養液 胰酶液 磷酸緩沖液
96 孔細胞培養板 10～200 ul 可調式加樣器 無菌小試管 血細胞計數器 倒置顯微鏡 普通顯微鏡 CO2 培養箱

步驟

1. MDCK 細胞培養

常規復蘇液氮凍存的 MDCK 細胞，接種于培養方瓶中，加入 7～10 ml DMEM 培養液，充分混勻，置 37℃ 培養 2～3d，待細胞形成致密單層備用。

2. 細胞懸液制備

MDCK 單層細胞一瓶，棄上清液，加 0.25％ 胰酶 1 ml，消化 2～5 min，待細胞完全脫壁后加入 3 ml DMEM 培養液，充分分散細胞取樣顯微計數，調整細胞濃度為 2×105～5×105 /ml。胰酶消化時間不宜過長，否則對細抱造成損傷。初學者可將細胞培養瓶置顯微鏡下觀察，細跑變圓脫壁即可。

3. 細胞接種

取 96 孔塑料細胞培養板一塊，用加樣器分別向每孔加入細胞懸浮液 200 ul。

4. 細胞培養增殖

細胞培養板置 37℃，5％ CO2 的培養箱中培養 24 h，細胞快速生長，形成 70％ 左右的單層可用于病毒接種。

5. 病毒稀釋

將病毒液在 5 ml 無菌試管內作連續 10 倍稀釋，即用 1 ml 吸管吸取 0.2 ml 病毒液，加到裝有 1.8 ml PBS 的第 1 支小試管內（10-1），充分混勻后，更換吸管，吸取 0.2 ml 加入第 2 管中，連續如此操作，繼續第 3 支稀釋，如此類推，稀釋到第 6 管。

病毒液中務必加少量胰酶（2.5 ug/ml），增強病毒的吸附力。

6. 病毒感

染從 CO2 培養箱中取出 96 孔細胞板，棄上清液，用 PBS 洗 2 次，于每孔加入不同稀釋度的病毒 100 ul，每稀釋度重復 8 孔。對照組以 100 ul PBS 代替病毒液，然后每孔補加新鮮的 DMEM 培養液100 ul，總體積為 200 ul。

7. 觀察細胞培養板置 37℃，5％ CO2 培養箱中繼續培養。逐日用倒置顯微鏡觀察細胞病變情況，至少觀察一周。