微生物分離純化實驗-稀釋涂布平板法
原理
該方法操作簡便，普通用于微生物的分離與純化。
其基本原理包括兩方面：
1. 選擇適合于待分離微生物的生長條件，如營養(yǎng)、酸堿度、濕度和氧等要求或加入某種抑制劑造成只利于該微生物生長，而抑制其他微生物生長的環(huán)境，從面淘汰一些不需要的微生物。
2. 微生物在固體培養(yǎng)基上生長形成的單個菌落可以是由一個細胞繁殖而成的集合體。因此可通過挑取單菌落而獲得一種純培養(yǎng)。獲取單個菌落的方法可通過稀釋涂布平板或平板劃線等技術(shù)完成。
材料與儀器
米曲霉 土樣
10％ 酚 無菌水 鏈霉素
肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基 淀粉瓊脂培養(yǎng)基（高氏 I 號） 馬丁氏瓊脂培養(yǎng)基 無菌玻璃涂棒 試管 無菌三角瓶 玻璃珠 無菌吸管 接種環(huán) 無菌培養(yǎng)皿 顯微鏡 記號筆
步驟
1. 倒平板
將肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基、高氏 I 號瓊脂培養(yǎng)基、馬丁氏瓊脂培養(yǎng)基加熱溶化，待冷至 55～60℃ 時，高氏 I 號瓊脂培養(yǎng)基中加入 10％ 酚數(shù)滴，馬丁氏培養(yǎng)中加入鏈霉素溶液（終濃度為30 μg/ml），混均勻后分別倒平板，每種培養(yǎng)基倒三皿。
倒平板的方法：右手持盛培養(yǎng)基的試管或三角瓶置火焰旁邊，用左手將試管塞或瓶塞輕輕地拔出，試管或瓶口保持對著火焰i然后用右手手撐邊緣或小指與無名指夾住管（瓶）塞（也可將試管塞或瓶塞放在左手邊緣或小指與無名指之間夾住。如果試管內(nèi)或三角瓶內(nèi)的培養(yǎng)基一次用完，管塞或瓶塞則不必夾在手中）。左手拿培養(yǎng)皿并將皿蓋在火焰附近打開一縫，迅速倒入培養(yǎng)基約 15 ml（圖 VII-1），加蓋后輕輕搖動培養(yǎng)皿，使培養(yǎng)基均勻分布在培養(yǎng)皿底部，然后平置于桌面上，待凝后即為平板。
2. 制備土壤稀釋液
稱取土樣 10 g，放入盛 90 ml 無菌水并帶有玻璃珠的三角燒瓶中，振搖約 20 min，使土樣與水充分混合，將細胞分散。用一支 1 ml 無菌吸管從中吸取 1 ml 土壤懸液加入盛有 9 ml 無菌水的大試管中充分混勻，然后用無菌吸管從此試管中吸取 1 ml（無菌操作見圖VII-2）加入另一盛有 9 ml 無菌水的試管中，混合均勻，以此類推制成 10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6 不同稀釋度的土壤溶液.
3. 涂布
將上述每種培養(yǎng)基的三個平板底面分別用記號筆寫上 10-4、10-5 和 10-6 三種稀釋度，然后用無菌吸管分別由10-4、10-5 和 10-6 三管室溫下靜置 5～10 min，使菌液吸附進培養(yǎng)基。
平板涂布方法：將 0.1 ml 菌懸液小心地濟在平板培養(yǎng)基表面中央位置（0.1 ml 的菌液要全部滴在培養(yǎng)基上，若吸移管尖端有剩余的，需將吸移管在培養(yǎng)基表面上輕輕地按一下便可）。右手拿無菌涂棒平放在平板培養(yǎng)基表面上，將菌懸液先沿一條直線輕輕地來回推動，使之分布均勻玻璃涂棒（見圖 VII-4），然后改變方向沿另一垂直線來回推動，平板內(nèi)邊緣處可改變方向用涂棒再涂布幾次。
4. 培養(yǎng)
將高氏 I 號培養(yǎng)基平板和馬丁氏培養(yǎng)基平板倒董于 28℃ 溫室中培養(yǎng) 3～5 d，肉膏蛋白胨平板倒置于 37℃ 溫室中培養(yǎng) 2～3 d。
5. 挑菌落將培養(yǎng)后長出的單個菌落分別挑取少許細胞接種到上述三種培養(yǎng)基的斜面上（圖 VII-3，C），分別置 28℃ 和 37℃ 溫室培養(yǎng)，待菌苔長出后，檢査其特征是否一致，同時將細胞涂片染色后用顯微鏡檢査是否為單一的微生物，若發(fā)現(xiàn)有雜菌，需再一次進行分離、純化，直到獲得純培養(yǎng)。
注意事項
值得指出的是從微生物群體中經(jīng)分離生長在平板上的單個菌落并不一定保證是純培養(yǎng)。因此，純培養(yǎng)的確定除觀察其菌落特征外還要結(jié)合顯微鏡檢測個體形態(tài)待征后才能確定，有些微生物的純培養(yǎng)要經(jīng)過一系列的分離與純化過程和多種特征鑒定方能得到。
