穿梭質粒
材料與儀器
帶有一個非URA3選擇標記YCp載體
缺失成分平板+Ura 含有5-FOA YCp質粒選擇性培養(yǎng)基的平板 YPD平板 YIP5載體
培養(yǎng)皿
步驟
1) 構建染色體上重要基因被破壞的單倍體菌株以及含有完整重要基因和URA3選擇標 記的YEp或YCp質粒。
2) 對于誘發(fā)突變，將重要基因亞克隆到帶有不同選擇標記的YCp載體上， 將大約10?20μg DNA采用羥胺或其他技術進行誘變?；蛘邔⒁粋€重要基因的突變衍生物克隆到YCp載體上。
3) 用乙酸鋰法將其轉化入第1步中的菌株，利用添加了尿嘧啶的缺失成分平板選擇 YCp質粒，在許可溫度下進行培養(yǎng)（一般為25℃)。在尿嘧啶存在的情況下，生長周期降低了對YEp質粒的選擇性，也就是在每個轉化菌落中，一部分細胞已丟失了（攜帶重要基因非突變拷貝的）質粒。但是應注意任何攜帶有來自于YCp質粒的未突變基因拷貝的轉化子不能失去YEp載體。
4) 將每個轉化平板都影印接種到兩塊含有5-FOA的平板上，同樣保持對YCp的選擇 性。將一塊平板在許可溫度下培養(yǎng)，另一塊在非許可溫度下培養(yǎng)（一般為36℃)。 作為對照，將每個轉化平板都影印兩個YPD平板并在相同的兩個溫度下培養(yǎng)。
5) 收集那些在許可溫度下產生Ura—乳突而在非許可溫度下不產生乳突的菌落（并在YPD培養(yǎng)基平板上在兩種溫度下都能正常生長），將它們劃線接種以產生單菌落。
6) 對每一個候選菌株檢驗約6個菌落，看它們在兩種溫度下是否都能產生乳突。
7) 對于每一個在步驟6中已經檢驗過的溫敏突變候選株，通過在保持YCp篩選的平板 上劃線的方法，回收在許可溫度下5-F0A平板上的Ura—乳突。從這些菌株（現在這些菌株應當只含有YCp質粒）分離質粒，將它們轉化到大腸桿菌
8) 將帶有溫敏突變的基因亞克隆到YIP5質粒中，通過移換技術將這一突變基因引入染色體。
注意事項
影印通過檢測一部分菌落是否丟失了 Ura+YEp質粒來區(qū)分不同種類的轉化子，Ura-的細胞表現為5-FOAr,因而從大多數Ura+的菌落背景中呈乳突狀生長。攜帶有來自于YCp質粒的未突變基因拷貝的轉化子在兩種溫度下都會表現出Ura-乳突，而攜帶有來自于YCp的溫度敏感突變的轉化子只能在許可溫度下才產生Ura_乳突。攜帶有無效突變基因的轉化子在任何溫度下都不會產生乳突。
