定位突變質(zhì)粒缺口修復(fù)技術(shù)和等位基因修復(fù)技術(shù)

材料與儀器

酵母菌株
帶選擇標(biāo)記的YRp或YCp質(zhì)粒 適當(dāng)?shù)南拗菩詢(xún)?nèi)切核酸酶 相應(yīng)選擇標(biāo)記突變的酵母菌 質(zhì)粒標(biāo)記的選擇培養(yǎng)基平板
培養(yǎng)皿

步驟

1）將目的基因亞克隆到帶恰當(dāng)?shù)倪x擇標(biāo)記的YRp或YCp質(zhì)粒上。

2) 在基因內(nèi)部的兩個(gè)限制酶酶切位點(diǎn)上切割以產(chǎn)生缺口，在缺口的兩側(cè)各留下40?200bP的同源區(qū)域，將得到的質(zhì)粒片段進(jìn)行凝膠純化。缺口或切口盡可能靠近突變

位點(diǎn)。

3) 如果用于致突變，通過(guò)PCR制備所需的致突變片段。如果是用來(lái)拯救或定位染色體等位基因，進(jìn)行步驟4。

4) 將1μg帶缺口的質(zhì)粒DNA和PCR產(chǎn)生的片段共同轉(zhuǎn)化入帶適當(dāng)標(biāo)記的酵母菌中。 如果是用缺口修復(fù)來(lái)拯救基因組等位基因，就單獨(dú)轉(zhuǎn)化帶缺口的質(zhì)粒。

5) 將轉(zhuǎn)化子接種在專(zhuān)用于質(zhì)粒標(biāo)記選擇平板上，鑒別成功修復(fù)的結(jié)果。對(duì)于恢復(fù)或定位染色體等位基因，利用質(zhì)粒分離技術(shù)鑒別選擇標(biāo)記不穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化子。 如果突變正好位于缺口區(qū)域內(nèi)，突變將會(huì)被修復(fù)的質(zhì)粒攜帶。當(dāng)突變位于缺口的附近時(shí)，其結(jié)果取決于交叉發(fā)生在什么部位。突變距離缺口區(qū)域越遠(yuǎn)，含有突變的質(zhì)粒就會(huì)越少。

6) 如果以PCR為基礎(chǔ)的突變作為突變發(fā)生的方案，篩選具有突變表型的轉(zhuǎn)化子。