二倍體細(xì)胞的孢子形成

材料與儀器

酵母菌細(xì)胞
孢子形成平板或孢子形成培養(yǎng)基 適當(dāng)?shù)臓I養(yǎng)成分 YPD培養(yǎng)基
平板

步驟

1）挑YPD或選擇性平板上的酵母菌單菌落接種在孢子形成平板上。如果無需選擇的話，細(xì)胞在轉(zhuǎn)移到孢子形成平板之前，可以在YPD平板上先培養(yǎng)幾天。單個菌落在YPD平板上生長3?4天，而對成小塊細(xì)胞來說，可在YPD平板上生長2天。這種預(yù)生長并 非必需的，但它可以使孢子形成的效率更高些。在轉(zhuǎn)移酵母細(xì)胞時，應(yīng)用少量細(xì)胞在孢子形成平 板上涂布相對較大的面積（約1cm2),不應(yīng)見到成團(tuán)的接種物。

2）于25℃培養(yǎng)4天。在較髙的溫度下孢子形成的效率一般很低。在缺乏氨基酸或其他酵母菌有絲分裂生長所必需的營養(yǎng)成分時，酵母菌就會進(jìn)行減數(shù)分裂形成孢子。某些特殊的酵母菌必須添加特定的營養(yǎng)成分孢子 形成才會更加完全。

3）在載玻片上滴一滴水，挑少量細(xì)胞稀釋在水中，于放大倍數(shù)250×?400×顯微鏡下觀察懸浮于水中的四分體孢子。

4）四分體呈成簇的4個小球（孢子），被固定于一個致密的子囊中。四個孢子排列為鉆石狀或正四面體狀。

常見問題

在瓊脂平板的表面，交配相反交配型的菌株可以構(gòu)建成二倍體（patch mating)。 具體做法是：在瓊脂平板（此平板應(yīng)允許兩種單倍體親本的生長）上的一個0.5 cm直徑的小圈中，用牙簽分別挑新鮮親本單倍體菌落，混雜在一起，于30℃交配4 h以上，然后將交配混合物劃線在選擇性平板上以選擇二倍體基因型。

如果二倍體基因型無特別的選擇標(biāo)志（當(dāng)單倍體親本中的一種具有與二倍體相同的營養(yǎng)需要時），使用解剖顯微鏡從交配混合物中“拉出合子”，可達(dá)到分離二倍體的目的。交配4 h以后，在適合二倍體生長的平板上將交配混合物畫幾條平行線，使用解剖顯微鏡通過其典型的形態(tài)確認(rèn)合子細(xì)胞，用分離針將它們挑出、與其他細(xì)胞分開，為了保證選擇的細(xì)胞確實是二倍體，將它們接種在孢子形成平板上,經(jīng)過適當(dāng)條件培養(yǎng)后，在顯微鏡下檢查四分體孢子的形成。也可采用另一種方法確認(rèn)：用一對交配型實驗菌株與選擇出的細(xì)胞進(jìn)行交配，在顯微鏡下檢査每個實驗株的合子形成情況，如果二倍體挑選正確，那么就不可能形成合子。