單細胞/微量核酸擴增方案

簡介

單細胞測序可以研究單個細胞內的基因情況，同時解決了用組織樣本測序無法解決的細胞異質性難題。但是我們常提到的單細胞測序方案并不是僅對單個或者幾個細胞進行測序，而是在單細胞分辨率下對成千上萬個細胞進行測序。那么如果真的只有一個細胞或極微量的核酸，又該采用什么手段對其基因組和轉錄組進行分析呢？單細胞/微量核酸擴增方案可以富集核酸樣本，應對后續各種分子研究。

原理

基于 MDA（多重置換擴增）技術，支持從單細胞或微量 DNA 開始進行全面均一的基因組擴增（針對 RNA 擴增需要先反轉錄成 cDNA，詳情請咨詢工作人員）。MDA 擴增技術依靠的 Phi 29 聚合酶是一種特殊的 DNA 聚合酶，其能夠以基因組 DNA 作為模板而實現長達 100 kb 的連續擴增，并可保證不從基因組模板上脫離。相對于傳統 PCR 的擴增方法，Phi 29 聚合酶因具有 3'→5'的外切酶校準活性而在擴增時具有比 Taq 聚合酶高 1000 倍的保真性。MDA技術在耐受外切酶活性引物存在的條件下可實現對多種哺乳動物以及細菌DNA 的高產量擴增。擴增產物后續可用于 NGS、三代測序、芯片、PCR 等多種分析方案。

材料與儀器

REPLI-g Single Cell Kit (QIAGEN)

Vortex 漩渦震蕩儀

PCR儀

步驟

1. 從單細胞樣本中擴增全基因組 DNA

1.1 根據需要進行的全基因組擴增反應數準備足夠的變性工作液 2（參照表 1）

注意：表 1 中的變性工作液 2 量足夠 12 次反應，剩余的變性工作液 2 可以在 -20℃保存不超過 3  個月。

1.2  將 4 μL 的起始細胞樣本液（保存于 PBS 中）加入到一微型離心管中。如果起始細胞液體積少于 4 μL，則通過加入 PBS sc（磷酸鹽緩沖液）使得終體積至 4 μL。

1.3  加入 3 μL 的變性工作液 2，并通過輕彈離心管及簡短離心來均勻混合各種液體。

1.4  在 65℃ 條件下孵育 10 min。

1.5  加入 3 μL 的 Stop Solution（終止液），通過輕彈離心管及簡短離心來均勻混合各種液體后，置于冰上。

1.6  將 REPLI-g sc DNA Polymerase（DNA 聚合酶）置于冰上解凍，并將其他試劑在室溫解凍，渦旋后簡短離心。

1.7  根據表 2 來準備預混液，混勻后簡短離心。

1.8  對于每個反應，在 10μL 的變性 DNA 溶液（1.5 步后）中加入 40 μL 的上述預混液。

1.9  30℃ 孵育 8 h。

1.10  將 REPLI-g sc DNA Polymerase（DNA 聚合酶）在 65℃ 失活 3 min。

1.11  如果不需要立即使用，可將擴增后的 DNA 放在 4℃ 短期保存或放置在-20℃長期保存。擴增后的 DNA 產量一般在 40 μg 每 50μL 反應，并且需要按照一定的適當比例進行稀釋。光學濃度（OD）測定會高估擴增 DNA 的產量。

2. 對純化后的基因組 DNA 進行全基因組擴增

2.1  根據需要進行的全基因組擴增反應數準備足夠的變性工作液 1（參照表 3 和表 4）

注意：表 3 和表 4 中的變性工作液 1 和中和緩沖液量足夠 12 次反應，剩余的變性工作液 1 和中和緩沖液量可以在-20℃ 保存不超過 3 個月。

2.2  將 2.5 μL 的模板 DNA 加入到一微型離心管中。

2.3  加入 2.5 μL 的變性工作液 1，漩渦并簡短離心。

2.4  在室溫孵育 3 min。

2.5  加入 5 μL 的中和緩沖液，渦旋并簡短離心后置于冰上。

2.6  將 REPLI-g sc DNA Polymerase（DNA 聚合酶）置于冰上解凍，并將其他試劑在室溫解凍，渦旋后簡短離心。

2.7  根據表 5 來準備預混液，混勻后簡短離心。

2.8 在 10 μL 的變性 DNA 溶液（2.5 步后）中加入 40 μL 的上述預混液。

2.9  30℃ 孵育 8 h。

2.10  將 REPLI-g sc DNA Polymerase（DNA 聚合酶）在 65℃ 失活 3 min。

2.11  如果不需要立即使用，可將擴增后的 DNA 放在 4℃ 短期保存或放置在-20℃長期保存。擴增后的 DNA 產量一般在 40 μg 每 50μL 反應，并且需要按照一定的適當比例進行稀釋。光學濃度（OD）測定會高估擴增 DNA 的產量。

注意事項

1. 該操作步驟針對各種來源的單細胞擴增而優化的，比如分選細胞、組織培養細胞以及細胞系等。該操作步驟不適用于經福爾馬林或其他交聯試劑固定過的細胞，如來源于福爾馬林固定、石蠟包埋組織樣本的激光顯微切割單細胞樣本。

2. 大約 40μg 的 DNA 產物也會存在于經過單細胞擴增反應的陰性（無模板）對照中，這些產品是反應體系中引物二聚體經過隨機延伸而得到的高分子量擴增產物。這些 DNA 并不會影響實際擴增樣本的質量，也不會在下游檢測過程中產生陽性結果。

3. 其他樣本類型也適用于此方法，包括：

 4. 除了全基因組擴增，基于 MDA 的技術也支持靶向區域擴增，如針對線粒體 DNA 的特異性擴增。