核酸雜交法篩選的簡(jiǎn)單介紹
利用堿基配對(duì)的原理進(jìn)行分子雜交是核酸分析的重要手段，也是鑒定基因重組體的常用方法。核酸雜交法的關(guān)鍵是獲得有放射性或非放射性但有其他類似放射性的探針，探針的 DNA或RNA序列是已知的。根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，先制備含目的DNA片段的探針，隨后采用雜交方法進(jìn)行鑒定。
核酸分子雜交的基本原理是：具有互補(bǔ)的特定核苷酸序列的單鏈DNA或RNA分子，當(dāng)它們混合在一起時(shí)，其特定的同源區(qū)將會(huì)退火形成雙鏈結(jié)構(gòu)。利用放射性同位素32P標(biāo)記的DNA或RNA作探針進(jìn)行核酸雜交，即可進(jìn)行重組體的篩選與鑒定。
在DNA雜交實(shí)驗(yàn)中，目的DNA先變性，然后把單鏈的目的DNA在高溫下結(jié)合到硝酸纖維素膜或尼龍膜上。單鏈DNA探針用放射性同位素或其他物質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記，與膜一起保溫。如果DNA探針與樣品中的某一核苷酸序列互補(bǔ)的話，那么通過(guò)堿基配對(duì)作用就可形成雜合分子，最后通過(guò)放射自顯影或其他方式檢測(cè)出來(lái)。通常，探針的長(zhǎng)度在100bp至1kb之間，但有時(shí)用小于100bp或大于1kb的探針，也能得到較好的效果。雜交的反應(yīng)條件非常重要，穩(wěn)定的結(jié)合往往需要在最少50個(gè)堿基的片段中至少80%的堿基完全配對(duì)。
DNA探針既可用同位素標(biāo)記，也可用生物素（biotin）等非同位素標(biāo)記物連接到其中一種脫氧核糖核苷三磷酸中，然后摻入到新合成的DNA鏈。要檢測(cè)這種標(biāo)記需要一種中間化合物——鏈霉抗生物素蛋白（streptavidin）。該化合物能與生物素結(jié)合，同時(shí)細(xì)胞自身帶有某種酶，可以催化形成有顏色的化合物，最后結(jié)果很容易易分辨出來(lái)。
核酸分子雜交的方法有：原位雜交、Southern 雜交及點(diǎn)雜交等。
將含重組體的菌落或噬菌斑由平板轉(zhuǎn)移到濾膜上并釋放出DNA，變性并固定在膜上，再同DNA探針雜交的方法稱為原位雜交。Southern 雜交是一種典型的異位雜交，1975年由Southern設(shè)計(jì)創(chuàng)建并以他的名字命名。該方法將重組體 DNA 用限制酶切割，分離出目的 DNA后進(jìn)行電泳分離，再將其原位轉(zhuǎn)至薄膜上，固定后用探針雜交。
