示蹤劑技術(shù)

為了確定構(gòu)成最終產(chǎn)物分子的初級代謝產(chǎn)物“建筑構(gòu)件”的來源，一種最有用的技術(shù)是應(yīng)用放射性同位素標(biāo)記的示蹤劑。將具有放射性同位素¹⁴C、³H或¹³C標(biāo)記的抗生素生物合成前體物質(zhì)加人生產(chǎn)該抗生素的微生物培養(yǎng)基中，最佳加人時間是微生物生長階段的末期，當(dāng)培養(yǎng)結(jié)束后，將抗生素分離、提純，然后測定結(jié)合到抗生素分子中的同位素，從放射性同位素的計數(shù)就可以獲得前體物質(zhì)結(jié)合到抗生素分子的程度。在分析數(shù)據(jù)時應(yīng)該注意兩點：一是示蹤物質(zhì)雖然是抗生素合成的前體物質(zhì)，但由于不能通過微生物的細胞壁吸收而得出不是前體物質(zhì)的錯誤結(jié)論，事實上如果該物質(zhì)能夠進人細胞內(nèi)就可以結(jié)合到抗生素分子中；二是在抗生素分子中雖然檢測出了示蹤物質(zhì)，但示蹤物質(zhì)已經(jīng)在細胞中通過其他代謝途徑降解，真正結(jié)合到抗生素分子的是示蹤物的降解產(chǎn)物。為了避免上述誤差，可以采用雙重標(biāo)記的示蹤物，如前體分子同時有¹⁴C和³H的標(biāo)記。

在確定了抗生素分子中結(jié)合進去了某一前體物后，下一個任務(wù)是確定該前體在抗生素分子結(jié)構(gòu)中的位置，這樣就要將抗生素分子降解為一定的小片段，然后確定標(biāo)記物在哪一個片段中，這是一個困難而又耗時的工作。一個比較有效的替代方法是用¹³C標(biāo)記的前體物。¹³C在自然界的豐度有11%，表面看來似乎會干擾測定結(jié)果，但它的優(yōu)點是能夠合成¹³C的含量高達99%的化合物，因此自然豐度的干擾可以忽略不計。將用¹³C合成的前體加入培養(yǎng)基中進行抗生素發(fā)酵，得到的產(chǎn)物可以直接用核磁共振（NMR）譜峰的高度增加值判斷抗生素分子的每個碳原子中¹³C所占的分數(shù)。如能采用雙重標(biāo)記的前體物，則可以根據(jù)譜峰多重性的高分辨分析和偶合常數(shù)來判斷兩個原來相連的原子在經(jīng)過復(fù)雜的代謝過程后是否還繼續(xù)相連，或連接鍵雖然已經(jīng)斷裂但經(jīng)不同的途徑結(jié)合到了抗生素分子中。

如果不能確定合理的前體物，則可以采用放射性標(biāo)記的更普通的底物分子，如葡萄糖或甘油，同時結(jié)合中間代謝產(chǎn)物的確定，也能對研究抗生素代謝途徑提供有用的信息。此外，用氘標(biāo)記的前體物產(chǎn)生的抗生素用NMR譜進行研究也很有用，氘在質(zhì)子共振譜中不出現(xiàn)譜峰，很容易鑒別。