斐林試劑比色法
[目的與要求]
1、掌握還原糖定量測定的原理和方法
2、學會分光光度計的使用
3、熟悉標準曲線的制作方法
[原理]
斐林 試劑 比色法是利用斐林試劑的甲、乙液混合后，甲液的硫酸銅與乙液的氫氧化鈉作用生成天藍色的氫氧化銅沉淀，該沉淀在堿性溶液中與乙液的酒石酸鉀鈉反應生成復雜的化合物（酒石酸鉀鈉銅）。
后者具有與普通銅鹽略有不同的天藍色，但仍有銅鹽所有的普通反應。天藍色的酒石酸鉀鈉銅在590nm波長處有最大吸收峰。
單糖和多糖的水解物都含有具還原性的醛基或是酮基，在堿性條件下煮沸能使斐林試劑中的二價銅離子還原為一價的氧化亞銅，而使藍色的斐林試劑脫色，脫色的程度與溶液中含糖量成正比。
椐此，在590nm波長處測定不同情況下溶液的光吸收值，并制作標準曲線，可求出樣品中糖的含量。
此法的優點是操作簡便，斐林試劑可不作定量配制，測定誤差在 ±0.02%，但須經常作標準曲線校正。缺點是試劑不穩定，需臨時配制，且容易受肌肝（酸）等的干擾，這在醫療分析上很不利。其測定范圍在0.1～0.5mg/mL還原糖，如果含糖量超過此范圍，誤差顯著增大。
[方法和步驟]
1、標準曲線制作
按下表在各 試管 中分別加入1mg/mL葡萄糖標準溶液0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3mL，并分別加蒸餾水補足到3mL，每管含葡萄糖各為0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0mg，分別在各管中加入2mL斐林試劑，混合后，在 試管 口用玻璃球蓋好，放入沸 水浴 加熱15min，取出后在流水中冷卻，再經1500r/min離心15min，取上清液在590nm波長處進行比色測定，以蒸餾水作比色時的參比，讀取含不同濃度糖的各管的光密度值和空白管的光密度值。然后把空白管的光密度值減去各管不同濃度糖的光密度值，并以此值作縱坐標，各相對的糖含量作橫坐標，繪制標準曲線。
試劑管號 | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 還原糖 | 總糖 |
1mg/mL葡萄糖/ mL | 0 | 0.5 | 1.0 | 1.5 | 2.0 | 2.5 | 3.0 | 1.5 | 1.5 |
斐林試劑/ mL | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 |
水/ mL | 3 | 2.5 | 2 | 1.5 | 1 | 0.5 | 0 | 1.5 | 1.5 |
總體積/ mL | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 |
A 590 |
2、樣品的測定
（1）還原糖提取液的制備
稱取2g馬鈴薯淀粉于150mL三角燒瓶中用少量水濕潤均勻，再加入約70mL水攪拌，50℃ 水浴 保溫15min，取出后定容至100mL即得20g/L馬鈴薯淀粉提取液。待自然沉淀或砂芯漏斗過濾后，取上清液1.5 mL進行還原糖的測定。
總糖水解液的制備
稱取1g馬鈴薯粉，置于150mL三角燒瓶中先用少量水濕潤均勻，加入6mol/L HCl 10mL，再加 蒸餾 水15mL。于沸水浴中加熱水解30min，冷卻后，用6mol/L NaOH調pH至中性，再定容至100mL，然后吸取10mL（如有不溶物應取上清液）稀釋至100mL，即得馬鈴薯粉總糖水解液。取水解液1.5mL如上表所示。
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