一步步教你利用Blast分析驗證引物序列
引物設計完成之后，需要用軟件 進行分析，找到最佳的引物對，采用Blast分析驗證引物，可以知道序列的正確性，也能知道引物的特異性狀況、引物的具體位置以及PCR產物的大小。
先找到需要設計引物的目標基因的在有引物序列的mRNA序列，可以通過全文（如最先發現該基因的文章），全文中有時可以找到大鼠c-jun mRNA序列的ACCESSION NUMBER，在PubMed中的“Nucleotide”中用此ACCESSION NUMBER就能找到序列。
可以利用這個ACCESSION NUMBER在PubMed中的“Nucleotide”中搜索到序列后，點擊右邊的“Links”，再點擊里面的“Related Sequences”就能找到所有的大鼠c-jun mRNA序列及其他物種 的一些c-jun mRNA序列。
文獻中的引物最好先驗證其序列正確，并用軟件 分析引物比較好后再采用。通過BLAST驗證，既可知道序列是否正確，也可同時了解引物的特異性、引物的位置及PCR產物的大小等。
如果僅僅是為了驗證引物序列是否正確（僅適合于基于完全匹配原則設計的引物），也可以用Blast的“Nucleotide-nucleotide BLAST (blastn )”或“Search for short, nearly exact matches”搜索，具體方法為：
1. 打開Blast，點擊“Nucleotide-nucleotide BLAST (blastn)”或“Search for short, nearly exact matches”
2. 等新頁面完全顯示后，將引物序列直接copy到“Search”框（沒有必要將下游引物序列轉換成其互補鏈），下面3種方法都可以（我覺得3種方法的搜索結果沒什么區別，沒仔細比較過哦！）
（１）直接拷貝上游引物序列，然后直接將下游引物序列拷貝在上游引物后面
（２）直接拷貝上游引物序列，在上游引物序列后加一空格，然后直接將下游引物序列拷貝在空格后面
（３）直接拷貝上游引物序列，換行，然后直接拷貝下游引物序列
注意：記住上、下游引物的長度，如上游引物為19bp、下游引物為18bp，這在查看Blast結果時有用。
3. 點擊“BLAST！”，新頁面完全出來以后，點擊“Format！”。
4. 結果完全出來后，查找有沒有和1-19、20-37同時完全匹配的基因，其他的就不用考慮了。當然，如果下游引物序列所對應的基因片段的
3'端正好和上游引物序列的3'端的1或2個堿基互補，那就可能是19-37或18-37。
如果有，那你的引物序列就是正確的。從文獻上查的引物，除了要用Blast驗證其序列是否正確外，還是應該用軟件 分析分析到底引物好不好。
實例
1、進入網頁：
http://www.NCBI .nlm.nih.gov/BLAST/
2、點擊 Search for short, nearly exact matches
3、 在search欄中輸入引物系列：
注：文獻報道ABCG2的引物為
5’-CTGAGATCCTGAGCCTTTGG-3’;
5’-TGCCCATCACAACATCATCT-3’
(1) 輸入方法可先輸入上游引物，進行blast程序，同樣方法在進行下游引物的blast程序。
這種方法較繁瑣，而且在結果分析特異性時要看能與上游引物的匹配的系列，還要看與下游引物匹配的系列——之后看兩者的交叉。
(2) 簡便的做法是同時輸入上下游引物：有以下兩種方法。輸入上下游引物系列都從5’——3’。
A、輸入上游引物 空格 輸入下游引物
B、輸入上游引物 回車 輸入下游引物
4、 在options for advanced blasting中：select from 欄選擇 Homo sapiens【ORGN】，Expect后面的數字改為10
5、在format中：select from 欄選擇Homo sapiens【ORGN】，Expect后面的數字填上0 10。
6、 點擊網頁中最下面的“BLAST!”
7、 出現新的網頁，點擊Format!
8、 等待若干秒之后，出現results of BLAST的網頁。該網頁用三種形式來顯示blast的結果。
(1)圖形格式：
圖中①代表這些序列與上游引物匹配、并與下游引物互補的得分值都位于40～50分
圖中②代表這些序列與上游引物匹配的得分值位于40～50分，而與下游引物不互補
圖中③代表這些序列與下游引物互補的得分值小于40分，而與上游引物不匹配
通過點擊相應的bar可以得到匹配情況的詳細信息。
(2)結果信息概要：
從左到右分別為：
A、數據庫系列的身份證：點擊之后可以獲得該序列的信息
B、系列的簡單描述
C、高比值片段對(high-scoring segment pairs, HSP)的字符得分。按照得分的高低由大到小排列。得分的計算公式=匹配的堿基×2+0.1。舉例：如果有20個堿基匹配，則其得分為40.1。
D、E值：代表被比對的兩個序列不相關的可能性。【The E value decreases exponentially as the Score (S) that is assigned to a match between two sequences increases】。E值最低的最有意義，也就是說序列的相似性最大。設定的E值是我們限定的上限，E值太高的就不顯示了
E、最后一欄有的有UEG的字樣，其中：
U代表：Unigene數據庫
E代表：GEO profiles數據庫
G代表：Gene數據庫
(3)結果詳細信息：
① 圈出來的部分代表序列的信息
② 第一個大括號代表上游引物與該序列的正鏈【Plus/Plus】的匹配情況：
共有21個堿基匹配，得分42.1分【21×2+0.1=42.1】，E值為0.020
上游引物與序列的2143～2163位點匹配
③ 第二個大括號代表下游引物與該序列的負鏈【Plus/Minus】的匹配情況：
共有20個堿基匹配，得分40.1分【20×2+0.1=40.1】，E值為0.077。
下游引物與該序列的29360～29379位點互補
注意點：
①上游引物為20個堿基，為什么會變成21個堿基呢?這是因為下游引物的第一個堿基為T，剛好與系列的2163位點的T匹配，因此下游引物的開頭的第一個堿基被當成了上游引物了。同理，上游引物的最后一個堿基為G，被當成了下游引物了。通過尋找有沒有與1～20位點、20～40位點完全匹配的序列，就可以避免這個因素的干擾了。
②為什么與上下游引物匹配的ABCG2序列有多種
A、 為同一個基因來源的不同的mRNA片段
B、 為該基因的DNA系列
C、 為同一個基因來源的不同的cDNA克隆片段
結果判斷：
①驗證文獻報道的引物是否正確：如果你可以在所顯示的結果中找出你的目的基因，一般說明你的引物正確性沒問題。如果你blast后沒有發現你的目的基因，或者分值很低，該引物就可能不適合用。
②檢測該引物是否存有同源序列相匹配，造成PCR反應的非特異擴增。如果上游引物和下游引物都找到的相同的基因，并且分數非常高。這種結果表明所設計的引物序列特異性不高，最好重新設計引物，否則會得到非特異擴增的PCR產物。
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